鹽度對天津厚蟹Na+/K+-ATPase、GDH 酶活性及GDH 基因表達的影響

左迪，馬長安，吳東蕾，張云飛

（1.上海城建職業學院健康與社會關懷學院，上海 201415；2.上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所，上海 201403；3.上海科技館，上海自然博物館自然史研究中心，上海 200041）

甲殼動物是長江口大型底棲動物的主要類群之一[1]。河口區域為甲殼動物提供棲息地，為一系列生命活動提供環境場所，但河口區域的環境因子變化較大，尤其是鹽度，會隨著漲落潮和四季交替而明顯變化[2]。河口甲殼動物通過滲透壓調節保障機體正常的生理活性，引人關注。天津厚蟹（Helice tientsinensis Rathbun）是長江口崇明東灘大型底棲動物的獨特優勢種和東灘保護區內候鳥的主要食物來源。附近村民常用落缸、鉤蜞等方式捕捉天津厚蟹，進行販賣或者制成醉蟹自用[3]。南匯東灘新圍墾大堤使堤壩內被圍潮灘與自然潮灘間的生境聯系被切斷，導致使被圍潮灘內鹽度淡化。而鹽度是蝦蟹類甲殼動物生長發育的重要因子[4]，直接影響蝦蟹類的生長、攝食、滲透壓調節和成活等生理功能[5]。

鹽度影響滲透壓調節的研究多涉及擬穴青蟹（Scylla paramamosain）[6]、鋸緣青蟹（Scylla serrata）[7]、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）[8]、三疣梭子蟹（portunus trituberculatus）[9,10]、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）[11,12]和南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）[13]等經濟蝦蟹，灘涂鹽度變化對天津厚蟹滲透壓調節相關酶活力及谷氨酸脫氫酶（GDH）基因的表達尚未見報道。本文采用實驗室內模擬崇明東灘圍墾后的鹽度淡化，探究鹽度變化對天津厚蟹滲透壓調節相關酶及基因表達的影響，為蝦蟹類甲殼動物滲透壓調節機制提供理論基礎，促進對甲殼動物生理生態的研究，也為后期長江口大型底棲動物的生態修復提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用蟹采自上海市崇明島東灘基地，選取頭胸甲（長）（22.78±1.53）mm，頭胸甲（寬）（25.56±1.42）mm，濕體質量（9.91±2.01）g，肢體完整的成蟹至于養殖箱（長×寬×高=1 m×0.5 m×0.5 m）中用于正式試驗，養殖期間水溫25～26℃左右，溶氧量高于6 mg/L，光周期14 L∶10 D，每天定時投喂中華園田螺（Cipangopal udina chinensis）螺肉（投喂量為蟹體質量的3%，根據天津厚蟹攝食量及飼料殘留情況及時調整投喂量，水體底部放置PVC 管及瓦片，防止個體間殘食，及時吸除剩余餌料及糞便等，隔天換水1/3 左右，持續充氧。鹽度調節所需海水晶購自上海市銅川路水產市場。

1.2 方法

試驗設6 個鹽度梯度，低鹽脅迫組（0、2、4）、高鹽脅迫組（16、32）和對照組（8），每組三個平行，每平行試驗選用健康的天津厚蟹14 只，共計用蟹252只。

1.2.1 樣品處理

分別于0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 和96 h，冰浴麻醉30 min 后取蟹肌肉和鰓組織，每試驗組取6 只蟹。將組織置于1.5 mL 無RNA 酶離心管后，迅速放入液氮中，-80℃保存，用于相關酶活性的測定以及GDH 基因在鹽度脅迫下的定量表達。

冰浴麻醉30 min 后，取對照組天津厚蟹各組織用于GDH 基因的克隆和Real-Time 中組織的特異性表達。

1.2.2 樣品測定

用超微量Na+/K+-ATPase 試劑盒測定該酶的活性。ATPase 活力定義為：每h 每mg 組織蛋白的組織中ATP 酶分解ATP 產生1 μmol 無機磷的量為一個ATP 酶活力單位。GDH 活性的測定采用南京建成生物工程研究所GDH 試劑盒，使用生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）。GDH 中免疫復合物顏色的深淺與樣品中GDH 的濃度呈正相關。

1.3 GDH 基因全長的克隆和表達分析

1.3.1 引物設計

根據Genbank 中其他蝦蟹類GDH 基因序列：中華絨螯蟹（JN628041）、擬穴青蟹（KM189809）、中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis，KF781120）、凡納濱對蝦（AM076955）、家蠶（Bombyx mori，DQ311359）等序列設計簡并引物GDH-F 和GDH-R；根據已知片段設計RACE 特異性引物G-3'F 和G-5'R；根據天津厚蟹GDH 基因全長cDNA 序列設計Real-Time PCR 引物RT-GF 和RT-GR（表1）。

表1 GDH 基因所用引物序列Tab.1 Primers used in GDH gene

1.3.2 GDH 基因的克隆

根據已獲得的天津厚蟹GDH 基因片段設計特異性引物G-3' 和G-5'，用于3' RACE 和5' RACE的擴增，反應條件為：94℃3 min（預變性）；94℃30 s（變性）；64℃30 s（退火），72℃1 min（延伸），30 個循環后；72℃10 min（延伸）；4℃保存。采用SMARTTMRACE cDNA 試劑盒（Clontech）克隆cDNA的全長。

1.3.3 GHD 基因的表達

根據已知GDH 全長cDNA 設計特異性引物，以天津厚蟹β-actin 為內參基因，采用熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）進行Real-Time PCR 反應，反應采用qRT-PCR 循環（兩步法），條件為：95℃2 min（預變性）；95℃15 s（變性），58℃30 s（退火），40 個循環，每樣品設3 次重復。

1.3.4 生物信息學分析

應用BlastX（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）進行同源性比對和相似性搜索；ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）分析開放閱讀框并預測氨基酸序列；SMART 4.0（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白結構域；N-J 法（Neighbor-Joining）構建系統進化樹。

1.4 數據分析

以SPSS 18.0 軟件進行數據統計分析，采用One-Way ANOVA 法進行分析，若存在顯著差異，再采用Duncan 檢驗法進行多重比較，數據以平均值（Mean,M）±標準差（Standard deviation,SD）表示，采用2-△△Ct法分析qRT-PCR 結果[14]。

2 結果與分析

2.1 天津厚蟹GDH 全基因序列分析

2.1.1 天津厚蟹GDH 序列特征分析

天津厚蟹cDNA 全長為2 105 bp（GenBank 登錄號：KJ649743），含有1 641 bp 的完整開放閱讀框（ORF），編碼546 個氨基酸。蛋白相對分子量（Mw）為60.54 kDa，理論等電點（pI）6.48。該蛋白氨基酸組成中，甘氨酸（Gly,G）含量最高，占比9.5%，其次為丙氨酸（Ala,A）、谷氨酸（Glu,E）和異亮氨酸（Ile,I），占比分別為7.9%、7.1%和6.8%，除吡咯賴氨酸（Pyl,O）和硒半胱氨酸（Sec,U）占比為0 外，色氨酸（Trp,W）和半胱氨酸（Cys,C）占比最低，為1.1%和1.5%。該蛋白包含一個信號肽，成熟肽527 個氨基酸，包含一個活性部位、兩個底物結合位點、兩個ATP 結合位點、三個N-糖基化位點、四個GDP 結合位點和四個NAD（P）結合位點（圖1）。

圖1 天津厚蟹GDH 基因序列及其推導的氨基酸序列Fig.1 GDH gene sequence and deduced amino acid sequence in mudflat crab mudflat crab Helice tientsinensis

2.1.2 天津厚蟹GDH 基因進化樹構建

氨基酸序列的BLAST 比對（圖2）結果顯示，其與多個物種的GDH 蛋白序列有較高的相似性，相似率在65%以上，同源性最高的為中華絨螯蟹，其次為擬穴青蟹和中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）。

圖2 天津厚蟹GDH 氨基酸序列與其他物種GDH氨基酸序列比對Fig.2 Alignment of GDH amino acid sequence of mudflat crab Helice tientsinensis with that of other species

利用MEGA4.0 軟件分析選取的17 條相似度較高的序列進化樹（圖3）。結果顯示，天津厚蟹首先與中華絨螯蟹聚為一支；其次與擬穴青蟹，凡納濱對蝦、中國明對蝦聚為一支，旋毛蟲（Trichinella spiralis）和環紋背帶線蟲（Teladorsagia circumcincta）與天津厚蟹的親緣關系最遠，而單獨聚成一支。

圖3 NJ 法構建GDH 基因進化樹Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree of GDH gene

2.2 天津厚蟹各組織中GDH 基因的表達

天津厚蟹GDH 基因在各組織中的表達結果：肌肉中GDH 基因表達量最高，其次為鰓，與其他組織差異顯著（P＜0.05）；GDH 基因在肝胰腺中表達量降低，極顯著低于肌肉組織（P＜0.01）（圖4）。

圖4 GDH 基因在天津厚蟹不同組織中的表達量Fig.4 Expression level of GDH gene in different tissues of mudflat crab Helice tientsinensis

2.3 鹽度脅迫對天津厚蟹GDH 基因表達量的影響

天津厚蟹GDH 基因在不同鹽度下的相對表達量差異表明，低鹽的0、2 和4 鹽度組24 h 內，鹽度越低表達量越高，至96 h 鹽度越低表達量越低，0和2 鹽度組GDH 基因表達量極顯著低于對照組（P＜0.01）（圖5）。

圖5 鹽度對天津厚蟹肌肉組織GDH 基因表達量的影響Fig.5 Effect of salinity on GDH gene expression level in muscle tissue of mudflat crab Helice tientsinensis

高鹽組中，基本鹽度越高天津厚蟹GDH 基因表達量越低，至96 h，16 鹽度組基因表達量顯著高于0、2、8、32 鹽度組（P＜0.05），隨著鹽度脅迫時間的增加，32 鹽度組基因表達量降低，至96 h GDH 基因表達量顯著低于對照組（P＜0.05）。

2.4 鹽度對天津厚蟹滲透壓相關酶活性的影響

2.4.1 鹽度對天津厚蟹GDH 活性的影響

天津厚蟹鰓GDH 活性變化如圖6 所示。低鹽組，鹽度越低GDH 活性越高，顯著高于對照組（P＜0.05），至96 h，0、2 鹽度組酶活性顯著低于對照組（P＜0.05），4 鹽度組GDH 活性與對照組無顯著差異（P＞0.05）。

圖6 鹽度脅迫對天津厚蟹鰓GDH 活性的影響Fig.6 Effects of salinity stress on GDH activity in gill of mudflat crab Helice tientsinensis

試驗中，48 h 內，對照組及高鹽脅迫組酶活性保持在較穩定水平，各組之間差異不顯著，至96 h，16 鹽度組GDH 活性升高，顯著高于對照組和其他鹽度組（P＜0.05）；32 鹽度組GDH 活性降低，酶活性高于0 鹽度組，但低于對照組，差異顯著（P＜0.05）。

由圖7 可知，低鹽脅迫（0、2、4）組中天津厚蟹肌肉組織中GDH 活性變化明顯，72 h 內，鹽度越低酶活性越高。0 和2 鹽度組酶活性至48 h 達最大值，極顯著高于對照組和其他鹽度組（P＜0.01），至96 h，低鹽脅迫組GDH 活性隨鹽度的降低而顯著降低，酶活性均小于對照組，各組之間差異顯著（P＜0.05）。6 h 后，高鹽組鹽度越高GDH 酶活性越低。96 h 內，16 鹽度組酶活性呈現先升高在降低的趨勢，至96 h 酶活性極顯著高于對照組和其他鹽度組（P＜0.01）；32 鹽度組GDH 活性保持在較穩定水平，至96 h，酶活性略低于對照組，差異不顯著（P＞0.05）。

圖7 鹽度脅迫對天津厚蟹肌肉GDH 活性的影響Fig.7 Effects of salinity stress on GDH activity in muscle of mudflat crab Helice tientsinensis

2.4.2 鹽度對天津厚蟹Na+/K+-ATPase 活性的影響

由圖8 可知，96 h 時，低鹽脅迫組（0、2、4）中，鹽度越低天津厚蟹鰓Na+/K+-ATPase 酶活性越高，48 h 0 和2 鹽度組Na+/K+-ATPase 酶活性達最大，與對照組差異極顯著（P＜0.01）；4 鹽度組Na+/K+-ATPase 酶活性24 h 達最大值，極顯著高于對照組（P＜0.01），隨后酶活性降低，至96 h Na+/K+-ATPase 酶活性略低于對照組，差異不顯著（P＞0.05）。

圖8 鹽度脅迫對天津厚蟹鰓Na+/K+-ATPase 酶活性的影響Fig.8 Effects of salinity stress on Na+/K+-ATPase activity in gill of mudflat crab Helice tientsinensis

高鹽組（16、32），鹽度越高酶活性越低，16 鹽度組酶活性高于32 鹽度組，6～72 h 高鹽組酶活性顯著低于低鹽度組，差異顯著（P＜0.05）；24 h 后16、32鹽度組組Na+/K+-ATPase 酶活性持續降低，至96 h酶活性均高于0、2 鹽度組，但顯著低于對照組（P＜0.05）。

鹽度對肌肉組織中Na+/K+-ATPase 活性的影響較小（圖9），僅12～48 h 內，酶活性與對照組相比差異顯著（P＜0.05），但各組之間差異不顯著（P＞0.05）。在低鹽脅迫（0、2、4）中，0～48 h，鹽度越低Na+/K+-ATPase 酶活性越高，至96 h，低鹽組Na+/K+-ATPase 酶活性顯著低于對照組（P＜0.05）。

圖9 鹽度脅迫對天津厚蟹肌肉Na+/K+-ATPase 酶活的影響Fig.9 Effects of salinity stress on Na+/K+-ATPase activity in muscle of mudflat crab Helice tientsinensis

高鹽脅迫組（16、32）中，鹽度越高Na+/K+-ATPase 活性越低，其中32 鹽度組酶活性變化范圍較小，基本呈持續降低趨勢，至96 h，16 鹽度組酶活性降低與對照組相比無顯著差異（P＞0.05），但顯著高于0 和2 鹽度組，32 鹽度組酶活性降低，顯著低于對照組（P＜0.05）。

3 討論

水體鹽度是影響蝦蟹類甲殼動物生理狀態的重要指標，而鹽度的變化直接影響蝦蟹類機體的滲透壓調節[15,16]。

天津厚蟹生活于廣鹽性的潮間帶，當外界鹽度發生變化時，機體通過主動調節來維持滲透壓的穩定，這也與其生活習性相一致[17]。水中鹽度的變化與Na+/K+-ATPase 酶活力變化密切相關[18]，同時GDH在甲殼動物滲透壓調節中起重要作用[19]。

GDH 在甲殼動物脯氨酸和丙氨酸等游離氨基酸合成代謝中具有十分重要的作用[20]，而脯氨酸和丙氨酸又是甲殼動物滲透壓調節中的重要角色[21]。天津厚蟹GDH基因在肌肉組織中表達量最高，可能與肌肉組織的成分或肌肉組織是機體重要的氨基酸庫有關[22,23]。鹽度脅迫后天津厚蟹GDH 酶活性及GDH 基因表達量均有不同程度的上升，酶活性的增強促使游離氨基酸，如丙氨酸和脯氨酸的合成，刺激機體主動調節滲透壓平衡，滿足了天津厚蟹滲透壓調節的需要。基因表達量的變化表明，GDH 可能參與天津厚蟹的滲透壓調節。至96 h，低鹽脅迫下天津厚蟹GDH 酶活性及GDH 基因表達量低于高鹽脅迫組，可能會影響游離氨基酸的合成，一定程度上影響天津厚蟹的滲透壓調節；高鹽組中16 鹽度組基因表達量高于對照組，32 鹽度組略低于對照組，酶活性的測定也表現出相似的結果，可能由于天津厚蟹對于高鹽滲透的調節能力更強，研究結果與羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergi）[24]、凡納濱對蝦[25,26]、中華絨螯蟹[27]研究結果相似。

低鹽脅迫組中，24 h 內天津厚蟹Na+/K+-ATPase酶活性隨著鹽度的降低而增強，這可能是機體對水體中鹽度變化的響應機制[28]，在低鹽狀態下，蟹類從外部水體中吸收Na+和Cl-，調節血淋巴中的離子濃度，補償鹽度降低對機體的影響[29]，通過Na+/K+-ATPase 酶活性的增強，促使天津厚蟹從水體中吸收更多的Na+，維持體內高滲環境的平衡[30]。但隨著低鹽脅迫時間的延長，Na+/K+-ATPase 酶活性降低，而Na+/K+-ATPase 酶在離子轉運上皮中起重要作用，酶活性的降低會進一步減弱細胞膜的通透性，從而降低細胞內攝入Na+的能力，最終影響機體內的滲透壓平衡[31]高鹽脅迫（16、32）下，水體中Na+和滲透壓高于天津厚蟹體內，機體不會通過擴散和排泄損失Na+，故高鹽脅迫下天津厚蟹Na+/K+-ATPase 酶活性明顯低于低鹽脅迫組，但至96 h，高鹽脅迫組Na+/K+-ATPase 酶活性高于0、2 鹽度組，一定程度上表明低鹽度更能夠刺激天津厚蟹的滲透壓調節，這也與鹽度脅迫下鋸緣青蟹、中華絨螯蟹[32]、克氏原螯蝦[33]Na+/K+-ATPase 酶的變化結果相似，但與三疣梭子蟹的研究結果相反，原因可能為天津厚蟹為典型的滲透壓調節型物種，而三疣梭子蟹為滲透壓隨變型物種，自身滲透壓調節能力較弱[34]。

天津厚蟹滲透壓調節過程的研究有助于了解其在濕地圍墾導致鹽度變化時的響應機制，研究發現，水體中鹽度變化影響天津厚蟹Na+/K+-ATPase、GDH 酶活性及GDH 基因表達量，而與高鹽脅迫相比，低鹽脅迫（2、4 鹽度組）對天津厚蟹的滲透壓影響更大，這也在一定程度上解釋了圍墾后（鹽度降低）天津厚蟹物種數量驟減或消失的原因[35]。