miR-17-5p 在尼羅羅非魚性腺中的表達及其對雌激素的應答反應特征

安麗霞，吳小葉，王偉偉

（1.晉中信息學院，山西 太谷 030801；2.山西農業大學動物科學學院，山西 太谷 030801；3.朔州市平魯區畜牧獸醫中心，山西 朔州 036000）

MiRNA-17-5p 是miRNA-l7-19 家族的成員，廣泛分布在動物多種組織中[1]。至今miRBase（22.0）數據庫中已注釋了37 個物種的miR-17-5p 序列，在脊椎動物中進化保守[2]，參與細胞分化[3]、調節生長[4]、與腫瘤細胞的增殖、凋亡等過程相關[5]。研究表明，miR-17-5p 在動物繁殖相關的過程中發揮著重要的作用。其中，miR-17-5p 對鼠黃體血管的形成必不可少[6]，而其在綿羊胎兒性腺和幼鼠的性腺中也具有高表達[7，8]。在斑馬魚（Barchydanio rerio var.）卵巢濾泡細胞中，miR-17-5p 在卵黃形成早期的表達量高于晚期[9]。miR-17-5p 作為抑制癌細胞的小RNA，其表達與雌激素水平相關，在人乳腺癌細胞（MCF-7）細胞系中，雌激素能改變其表達量[5]。目前，有關尼羅羅非魚性腺中miR-17-5p 的表達以及魚類性腺中miR-17-5p 對雌激素應答反應特征等尚未見相關研究。本研究采用熒光定量PCR 的方法檢測了miR-17-5p 在尼羅羅非魚性腺中及雌二醇（E2）處理后性腺中的表達特征，并采用生物信息軟件預測了miR-17-5p 的靶基因，對靶基因進行了生物信息學分析，為進一步研究miR-17-5p 在尼羅羅非魚性別控制的潛在調控功能提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

1.1.1 miR-17-5p 在尼羅羅非魚性腺中的表達

60 日齡的尼羅羅非魚雌、雄魚各6 尾，麻醉后解剖取其精巢和卵巢，放于液氮中速凍，隨后-80℃保存，用于提取總RNA。

1.1.2 雌二醇對miR-17-5p 在尼羅羅非魚性腺中表達的影響

取雌雄的尼羅羅非魚幼魚各50 尾，平均體質量為（43.1±0.2）g，平均體長為（11.2±0.1）cm，分為4 組：雌二醇處理雄魚組、對照雄魚組、雌二醇處理雌魚組和對照雌魚組，每組25 尾。雌二醇先用無水乙醇溶解后，再用芝麻油按照體積比1∶10 稀釋，胸鰭基部腹腔注射，濃度為10 mg/kg 體質量。對照組注射無水乙醇與芝麻油（體積比1∶10）的混合液。注射2 d、7 d、14 d、21 d 和28 d 時，取實驗魚精巢和卵巢組織（每次每組各取4 尾魚），置于液氮中速凍后，于-80℃低溫冰箱中保存備用。

1.2 總RNA 的提取

根據文獻[10]提取精巢和卵巢總RNA，測定RNA的濃度和完整性。

1.3 引物設計與合成

根據測序獲得的尼羅羅非魚miR-17-5p 序列設計特異性引物：5'-CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTA-3'，引物由上海生工合成，下游引物為TAKARA試劑盒自帶的通用引物。

1.4 反轉錄和熒光定量

利用SYBR PrimeScriptTMmiRNA RT-PCR 試劑盒（TaKaRa，RR716）對總RNA 中的miRNA 及其他小RNA 進行Poly（A）加尾反應，然后利用Universal Adaptor Primer 進行反轉錄得到cDNA，最后進行熒光定量，具體方法見參考文獻[10]。利用2-ΔΔCT計算miR-17-5p 的相對表達量，利用SPSS 軟件分析表達差異。

1.5 miR-17-5p 靶基因預測及其靶基因的生物信息學分析

由于羅非魚的相關信息沒有在miRNA 靶基因預測軟件數據庫中收錄，所以miR-17-5p 的靶基因預測以斑馬魚基因組為基礎進行。利用DIANA TOOLS 軟件（http://diana.imis.Athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=site/index）和TargetScan 軟件（http://www.Targetscan.org/fish_62/）分別進行靶基因預測，然后利用Venny 軟件（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）取2 種算法預測的靶基因的交集，并利用上海伯豪生物技術有限公司的富集軟件（http://enrich.shbio.com/index/ga.asp）對交集靶基因進行Gene ontology 富集分析和KEGG pathway分析。

2 結果與分析

2.1 尼羅羅非魚性腺中miR-17-5p 表達差異

miR-17-5p 在尼羅羅非魚精巢和卵巢組織中均有表達，在卵巢中的表達量為精巢的10 余倍，極顯著高于精巢（P＜0.01）（圖1）。

圖1 miR-17-5p 在尼羅羅非魚精巢和卵巢中的表達差異Fig.1 Expression difference of miR-17-5p in testis and ovaries of Nile tilapia

2.2 尼羅羅非魚幼魚經17α-乙炔雌二醇處理后，性腺中miR-17-5p 的表達變化

17α-乙炔雌二醇處理尼羅羅非魚幼魚后，性腺中miR-17-5p 的表達量變化顯著。與對照組相比，E2 處理后2d、7d、14d 和21d，卵巢中miR-17-5p的表達量顯著降低（P＜0.05），28 d 后，其表達量呈上升趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）。17α-乙炔雌二醇處理2 d 和7 d 后，精巢中miR-17-5p 的表達量分別極顯著和顯著降低，至14 d 時表達量回升高。注射E2 后，性腺中miR-17-5p 表達趨勢仍為精巢的表達量顯著低于卵巢（P＜0.01）（圖2）。

圖2 17α-乙炔雌二醇處理尼羅羅非魚后精巢和卵巢中miR-17-5p 表達量的變化Fig.2 Change in expression level of miR-17-5p in testis and ovaries of Nile tilapia exposed to 17α-ethinyl estradiol

2.3 通過軟件預測miR-17-5p 的靶基因

通過DIANA TOOLS 和TargetScan 軟件分別預測出miR-17-5p 的潛在靶基因分別為526 和6 612個，其交集靶基因為333 個（圖3）。

圖3 Diana 與Targetscan 預測的miR-17-5p 靶基因的交集數Fig.3 The intersection of miR-17-5p target genes predicted by Diana and Targetscan

2.4 交集靶基因的功能分析

利用伯豪公司的富集軟件對333 個交集靶基因的Gene ontology 分析和KEGG 通路分析見圖4。Gene ontology 分析結果顯示，333 個靶基因中有238個基因分別富集到了214 個生物學過程條目（Biological process）、72 個分子生物學功能條目（Molecular function）和31 個細胞組分條目（Cellular component）。顯著富集的前30 個GO 條目（圖4），主要包括生長、發育、代謝和蛋白質修飾等相關過程，其中與繁殖相關的FZD3B、CAPRIN2、WNT8B、WNT9B和SMO 富集到了經典WNT 信號通路（canonical Wnt signaling pathway）。除這5 個基因外，MYLIPA富集到了WNT 信號通路（Wnt signaling pathway）。

圖4 交集靶基因GO 富集分析Fig.4 GO analysis of intersection target genes

KEGG 通路分析結果顯示，333 個交集靶基因中83 個基因富集到72 個KEGG 通路，顯著富集的前30 個KEGG 通路見圖5。與繁殖相關的通路有MAPK 信號通路（包括的靶基因有：GNG12A、TAOK3B、MAP3K3、TAOK3A、FGF4 和CHUK）、TGFbeta 信號通路（包括的靶基因有：AMH 和SMAD1）、WNT 信號通路（包括的靶基因有：FZD3B、WNT8B、PLCB3 和WNT9B）和孕酮調節的卵母細胞成熟通路（包括的靶基因有：PDE3B 和SPDYA）。SPDYA 和PLCB3 分別富集到了卵母細胞減數分裂通路和GnRH 信號通路中。

圖5 交集靶基因KEGG 通路分析Fig.5 KEGG pathway analysis of intersection target genes

3 討論

有研究表明，miR-17-5p 是在多種組織廣泛表達的短鏈非編碼RNA，參與生長、細胞的分化和腫瘤細胞的增值、凋亡等[3-5]。MiR-17-5p 在妊娠42 d的綿羊胚胎雌雄性腺中高表達，而妊娠72 d 則表達較低[7]。MiR-17-5p 在幼鼠發育的卵母細胞的卵子發生期高表達[8]、原生殖細胞和精原細胞中均高表達[11]。斑馬魚（Barchydanio rerio var.）卵巢濾泡細胞中，miR-17-5p 表達量在卵黃形成的早期高于晚期，且用人絨毛膜促性腺激素（LH）處理后，濾泡細胞中miR-17-5p 的表達顯著降低，但不影響其在卵母細胞中的表達[9]。而與無卵黃期的肝臟相比，斑馬魚的有卵黃期肝臟miR-17-5p 表達水平高[12]。這些研究說明miR-17-5p 在動物繁殖中發揮重要作用。miRNA-17-92 家族的miRNA 在鼠的卵子發生過程中是細胞增殖的促進劑和細胞凋亡的抑制劑[8]。本研究中，60 日齡的尼羅羅非魚處于精子和卵子發育的關鍵時期，miR-17-5p 在精巢和卵巢中均有表達，且在卵巢中的表達量顯著高于精巢，說明miR-17-5p 參與魚類幼魚的性腺發育。

雌激素是一種類固醇激素，參與多種細胞和生理過程以及癌癥等疾病的發展，在魚類的性別決定和性腺發育中發揮重要作用。已有研究證實，miRNA 參與雌激素信號通路和代謝，也可調節miRNA的表達[13]。雌激素可直接調節miRNA 的轉錄，也可通過調節miRNA 生物合成通路上的關鍵酶和元件，調控miRNA 的產生和發揮功能[12]。在疾病研究中，乳腺癌的誘因之一就是擾亂的雌激素信號。雌激素處理人乳腺癌細胞系（MCF-7），會引起一系列miRNA 表達降低[14]。miR-17-5p 作為抑制癌細胞的小RNA，在該細胞系中，雌激素（E2）能使其表達降低[5]。雌激素暴露后，斑馬魚肝臟中的miRNA 表達量會降低[12]，但是，miR-17-5p 的表達未發生顯著變化。本研究中，尼羅羅非魚幼魚腹腔注射雌二醇后，精巢和卵巢中的miR-17-5p 表達量均顯著降低后又升高，這說明在尼羅羅非魚幼魚的性腺中雌激素能夠顯著降低miR-17-5p 的表達，調控性腺發育。

miRNA 的功能是轉錄后水平微調靶基因的表達。靶基因預測是研究miRNA 功能的重要手段。本研究采用不同的方法對miR-17-5p 的靶基因進行預測，并對靶基因取交集，進行GO 分析發現，多個基因富集于WNT 信號通路。研究表明，WNT 信號通路可促進綿羊卵泡的發育，其表達與雌激素濃度呈正相關[15]。雌二醇可以調控WNT 信號通路基因的表達[16]。WNT9B 基因對哺乳動物生殖系統具有重要作用，完全敲除WNT9B 基因后，雌小鼠輸卵管和子宮缺失，雄鼠附睪和輸精管缺失，但卵巢和精巢組織正常[17]。對miR-17-5p 交集靶基因的KEGG分析發現，與繁殖相關的除了WNT 信號通路外，還包括MAPK、TGF-beta、卵母細胞成熟、卵母細胞減數分裂和GnRH 等信號通路。MAPK 信號通路參與調節精子的發生、成熟、凋亡，及精子獲能和頂體反應等繁殖過程[18]，其中FGF4 基因可誘導精子發生[19]。TGF-beta 信號通路在哺乳動物的卵泡發生和排卵過程以及配子形成過程中發揮重要作用。AMH（抗苗勒管激素）在雌性青春期之前都不表達[20]，性成熟后，卵巢的顆粒細胞進行有絲分裂，AMH 會高表達[21]。AMH 在雄性青春期前睪丸組織高表達，與支持細胞的有絲分裂活性相關，參與精子發生[22]。SMAD1 對精子發生、發育和成熟起重要調節作用[23]。卵母細胞減數分裂和成熟通路以及GnRH 信號通路都與性腺發育密切相關。SPDYA 基因能促進非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵的細胞周期G2 期到M 期的轉換[24]。miR-17-5p 靶基因的預測和功能分析有助于進一步分析miR-17-5p 在魚類性腺發育中的作用。雌二醇也會影響這些靶基因所在的信號通路[16]，它們彼此間的具體調控網絡有待于進一步的研究。

結論

本研究發現，miR-17-5p 在尼羅羅非魚幼魚的精巢和卵巢中均表達，在卵巢中顯著高表達，說明miR-17-5p 參與尼羅羅非魚幼魚的性腺發育。用雌二醇處理后，精巢和卵巢中miR-17-5p 表達量顯著降低，說明雌二醇可以抑制該miRNA 的表達。多種軟件預測出的靶基因取交集后，多個靶基因富集與性腺發育以及繁殖相關的通路，為分析miR-17-5p的靶標關系奠定基礎，為進一步研究其在魚類性別分化和控制中的作用提供理論依據。