基于肝星狀細胞調控的肝纖維化治療機制相關研究概述

牛媛媛，汪龍德，毛蘭芳，胥文娟，張萍，符博雅

(1.甘肅中醫藥大學，蘭州 730000； 2.甘肅中醫藥大學附屬醫院消化科，蘭州 730020)

肝纖維化是由多種復雜病因引起的慢性肝損傷所致的以細胞外基質(extracellular matrix，ECM)蛋白(主要是Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白)過度凈積累而形成的纖維性瘢痕，進而取代受損的正常組織為特征的一系列動態過程[1]。多數學者認為，肝纖維化由肝毒性損傷和膽汁淤積損傷兩種類型的慢性肝損傷所引起[2]。在嚴重且持續的病理刺激下，肝纖維化可發展為更嚴重的肝硬化，若肝腺泡被結節取代，則進一步惡化為肝細胞癌。肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)最早于1876年由Carl-von Kuffer提出，其明確定位于竇周隙的內皮下，大致分布在肝竇內皮細胞與肝細胞之間，約占所有常駐肝細胞的10%[3]。正常情況下，HSCs表現為持久穩定的靜止型，以血管周圍脂質液滴的存在和薄突起延伸為特點，但其在受損肝臟中激活可促進膠原蛋白分泌和纖維瘢痕組織形成，進而導致慢性肝纖維化或肝硬化[4]。越來越多的證據表明，肝損傷或體外培養后HSCs被激活，從靜止的、維生素A儲存細胞轉分化為具有增殖、收縮、纖維形成、基質降解改變、趨化性和炎癥信號的肌成纖維化細胞樣細胞類型，被認為是實驗性和人類肝損傷啟動肝纖維化的關鍵驅動因素[5]。大量動物實驗和臨床研究數據顯示，在肝纖維化消退過程中，損傷因素消失且積極有效治療肝組織的纖維化進程可減緩甚至逆轉[6]。值得注意的是，通過細胞凋亡或表型轉化(恢復到靜止狀態)來減少活化的HSCs數量在肝纖維化逆轉過程中具有重要地位[7]。此外，HSCs的活化受限、免疫清除和衰老也參與活化HSCs的清除[8]，理論上，上述調控機制可發揮抗肝纖維化作用，從而抑制或逆轉肝纖維化的發生和發展[9]。現對HSCs調控的肝纖維治療機制的相關研究予以綜述，以期為慢性肝病的防治提供新思路。

1 HSCs激活前的干預階段

在肝損傷過程中，轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β1等細胞因子通過旁分泌等方式激活HSCs，而TGF-β1的產生可以促進并維持一個自分泌循環中膠原蛋白基因的表達，同時上調金屬蛋白酶組織抑制劑的表達，導致ECM沉積和纖維化[10]。肝纖維化進程中的各個重要環節及作用靶點離不開多種信號通路的參與及綜合調控。如姜黃素可通過調控TGF-β/Smad2信號通路升高過氧化物酶體增殖物激活受體γ水平，降低血小板源性生長因子、TGF-β1及其相應受體和Ⅰ型膠原蛋白的水平，對HSCs的活化起重要的反向作用[11]。此外，α干擾素可抑制HSCs激活，其作用機制主要依賴于脂質過氧化產物水平的降低以及與細胞氧化活性迸發，進而調控HSCs阻斷或逆轉肝纖維化進展[12]。自噬作為肝臟代謝穩態的紐帶，對維持肝臟正常生理功能有重要意義，病理因素刺激下，自噬可通過裂解細胞質滴內的視黃醇酯產生脂肪酸，驅動HSCs的激活。相關研究發現，在自噬調節因子、自噬相關蛋白7 特異性缺失小鼠中，外源性四氯化碳的誘導作用不變，而纖維形成和ECM積累顯著減少[13]。采用自噬抑制劑-巴菲霉素A1處理HSCs可明顯降低細胞增殖活力和HSCs激活相關標志物的基因表達[14]，提示可通過調控細胞自噬抑制或預防HSCs的激活，進一步減少促使肝纖維化發生或加重病理組織損害，緩解疾病程度，這可作為抗肝纖維化研究的新切入點。

充足的物質能量供應是機體賴以生存和繁衍的必要前提，而HSCs的激活需要持續且不間斷的細胞內能量供應，若細胞內能量供應失衡或停滯，則ECM的合成與分泌受阻。在一項相關臨床前研究中，溴丙酮酸(亞致死劑量的能量阻滯劑)可通過干擾能量代謝促進活化的HSCs表型改變，進而減少ECM的分泌[15]。在未來精準醫療實施的大背景下，能量阻滯劑的應用可能是多種疾病(包括心力衰竭)的有價值的治療靶點之一。

Hedgehog (Hh)通路是一個由配體、受體和轉錄因子組成的多功能復雜系統。當Hh配體與補丁同系物結合時，光滑的同系物被激活，進而啟動信號并進一步驅動靶基因的轉錄，包括調控細胞存活、增殖、遷移和分化的骨橋蛋白[16]。研究表明，基于Hh通路的藥理學和遺傳學方法可以減少肝纖維化和HSCs活化[17]。與野生型小鼠相比，缺乏蛋氨酸和膽堿喂養的補丁同系物雜合子小鼠Hh通路的激活在一定程度上增強，骨橋蛋白表達增加，肝纖維化程度加重[18]。但另有研究顯示，喂食蛋氨酸和膽堿缺乏飼料的骨橋蛋白缺乏小鼠的纖維化減少[19]，提示相同飲食誘導刺激下，Hh通路的激活與骨橋蛋白存在協同作用，對HSCs的活化狀態及纖維化的發展進程有重要影響，而阻斷活化的HSCs的Hh信號通路可作為抗肝纖維化的治療策略之一。

2 HSCs激活后的中間階段

2.1促進HSCs表型轉化 表型轉化可使活化的HSCs恢復到靜止狀態，進而減少纖維化前細胞因子的分泌和ECM的沉積[20]。然而，去活化的HSCs并不會完全恢復到此前的絕對靜止狀態，而是處于預先激活的中間狀態，在某種程度上此中間狀態更易受到后續的損傷刺激。Andrade等[21]研究發現，Ecto 5-核苷酸酶通過腺苷一磷酸的衰減和腺苷脫氨酶活性的降低，調節活化的HSCs進入靜止狀態。相關證據指出，纖溶酶原可以恢復靜止的HSCs表型，主要通過對非纖維蛋白基質成分的蛋白水解起作用[22]。即使在肌成纖維細胞被激活的情況下，HSCs也可通過上調抗凋亡基因Hspa1a/b恢復靜息樣表型[23]。Moran-Salvador等[24]指出，通過協同下調促皮質素和脂氧合酶的表達，上皮細胞生長因子和纖維細胞生長因子可使活化的HSCs恢復中間狀態。但HSCs激活狀態的鑒定及評估與表型逆轉的系統調控仍有待進一步深入研究。肝纖維化的主要決定因素、基因表達、表觀遺傳機制包括DNA甲基化、非編碼RNA和組蛋白翻譯后修飾，在一定條件下可使HSCs保持部分靜止狀態[25]。綜上所述，控制失活HSCs穩定性及可逆性、恢復HSCs靜止狀態、避免有害刺激引起肝損傷發作的方法均需要進一步研究。

2.2免疫清除 病理損害過程中，HSCs啟動主動選擇程序，通過促進炎癥細胞的募集放大受損肝臟的炎癥反應，而免疫細胞可通過減少活化的HSCs數量對上述過程產生拮抗作用，甚至逆轉肝纖維化[26]。膠原酶活性的增加是纖維化消退的主要途徑之一，在纖維組織分解階段，活化的巨噬細胞通過分泌基質金屬蛋白酶發揮重要的調節作用[27]。一方面，巨噬細胞可全方位增加基質金屬蛋白酶9和腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的表達，進而促進肌成纖維細胞凋亡；另一方面，巨噬細胞對凋亡細胞的吞噬作用可誘導纖維化模型中基質金屬蛋白酶的表達，并增強ECM的降解[28]。自然殺傷細胞(natural killer cells，NK細胞)和NKT細胞是淋巴細胞，它們可以合成和分泌多種細胞因子，并在狀態激活后直接殺傷或消滅HSCs[29]。此外，NK細胞還可誘導早期活化和衰老的HSCs凋亡，主要通過腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體介導的途徑或在未完全激活HSCs中表達維甲酸早期誘導1來實現[30-31]。另有相關證據指出，NKT細胞也可改善肝纖維化程度，這與其通過釋放白細胞介素-30選擇性清除活化的HSCs密不可分[32]。CD4+T淋巴細胞(包括輔助性T細胞1、輔助性T細胞2、輔助性T細胞17和調節性T細胞)是目前已知的重要免疫應答調節劑之一，其通過不同途徑對損傷應激產生直接或間接影響，最終促進肝纖維化靜默[33]。Reifart等[34]的研究發現，肝組織在缺血再灌注損傷情況下，內源性大麻素受體CB-1和CB-2的參與可使HSCs的CD4+T細胞減少或失去活性。活化T細胞產生的白細胞介素-22可通過誘導白細胞介素-10R2和白細胞介素-22R1的表達，增加衰老相關-半乳糖苷酶的數量與活性，誘導活化的HSCs衰老，這對改善肝纖維化具有積極而深遠的影響[35]。需要特別強調的是，共同的信號刺激和免疫檢查點之間的平衡決定了細胞毒性 T細胞的激活和免疫反應強度[36]，在此基礎上通過激活T細胞誘導的HSCs衰老可能成為治療肝纖維化的新策略。但上述推測需要大量臨床前和臨床試驗的驗證，機體免疫系統及多種細胞因子的交互作用在清除活化HSCs方面具有重要作用。

3 HSCs衰退的后期階段

3.1促進HSCs凋亡 細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，在肝纖維化發展過程中HSCs的增殖和凋亡可維持HSCs數量的平衡，一旦HSCs動態平衡被打破，細胞凋亡便可抑制甚至消除HSCs的激活[37]。在急性肝損傷中，未完全激活的HSCs可以通過細胞凋亡被消除，但這種機制并不能完全恢復肝組織的完整性，故應將這種漸進性傷害控制在一定范圍內，以防止肝損傷進一步惡化[38]。Elsharkawy等[39]對HSCs凋亡在逆轉肝纖維化中的作用和調控的研究發現，實驗性增強HSCs凋亡可促進纖維化消退，說明死亡受體配體、細胞外基質成分和免疫調節因子、信號轉導蛋白與轉錄因子等的協同作用可延緩纖維化進程。研究表明，經傳統工藝進行修飾的改良柑橘果膠可通過抗氧化活性和抑制半乳糖凝集素-3誘導HSCs凋亡，進而阻止肝纖維化進展[40]。薯蕷皂苷通過調節TGF-β1/Smad、Wnt/β聯蛋白、促分裂原活化的蛋白激酶以及線粒體信號通路誘導HSCs凋亡，發揮抑制肝纖維化的作用[41]。相關研究發現，在某種程度上，丹參酮Ⅱa通過誘導DNA斷裂、聚酯纖維聚合酶和胱天蛋白酶3裂解、提高B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白/B細胞淋巴瘤-2蛋白比例促進線粒體膜去極化以及細胞色素C在細胞質中的釋放，顯著誘導S期細胞周期阻滯，下調細胞周期蛋白A、細胞周期蛋白E和細胞周期蛋白依賴性激酶，從而促進HSCs的凋亡，逆轉或阻滯肝纖維化的發展[42]。研究證實，HSCs凋亡離不開可溶性生長因子和細胞因子、纖維基質成分和死亡受體等的刺激，以及多種信號通路介導的調節[43-44]。因此，HSCs作為肝纖維化發生發展的效應細胞，其表型的動態變化及任何環節的波動均在肝纖維化防治中起重要作用，提示關注與調控HSCs凋亡的相關基因及多種新信號通路之間串擾的綜合調節可為研發新的抗纖維藥物提供參考靶點。

3.2誘導HSCs衰老 與細胞凋亡不同，細胞衰老是一種由基因控制的機體生理功能的自然衰退，它可在有限的增殖能力內限制細胞分裂，以防止基因損傷細胞的過度積累[45]。一項關于非人類靈長類動物衰老的肝竇假毛細血管化的研究顯示，衰老的狒狒并沒有表達與年齡密切相關的HSCs激活的標志物，表明衰老的人類或其他非人類靈長類動物的HSCs并沒有被激活[46]。此外，停止增殖的衰老HSCs仍可增強NK細胞功能、促進免疫細胞募集、加速免疫細胞清除，同時上調基質降解酶表達，下調ECM蛋白表達，使ECM的合成與降解達到動態平衡，有助于逆轉肝纖維化過程[47]。p53/p21通路介導的細胞衰老抑制了活化的HSCs的增殖能力，使小鼠肝纖維化程度降低[48]，提示通過不同方式及手段誘導HSCs衰老可能是抗纖維化的策略。富半胱氨酸蛋白61通過活性氧類誘導的細胞衰老、凋亡及TGF-β信號的衰減方式，在原發性門靜脈肌纖維的成纖維細胞中發揮抗纖維化作用[49-51]。另有研究表明，塞來昔布衍生物OSU-03012通過誘導衰老抑制HSCs的增殖和活化[52]，提示臨床用藥的多元性及多學科交叉融合將為抗肝纖維化的治療提供新思路及新方法。

4 小 結

調節HSCs可以預防和治療肝纖維化，其方式包括抑制HSCs的激活、促進HSCs表型轉化、免疫清除、促進HSCs凋亡及誘導HSCs衰老等綜合調控。此外，目前纖維化研究的主要焦點之一是開發具有高肝特異性的靶向治療(包括活細胞、磁性顆粒或受控磁力)，這種治療可耐受并促進多余間質基質的降解與清除，其可能成為逆轉肝纖維化的有效手段之一。然而，免疫細胞、細胞因子治療、特異性基因調控誘導細胞凋亡的能力還有待進一步研究。目前學者對肝纖維化研究的多集中于HSCs的活化及其表型轉歸，而忽略了維持肝臟正常生理功能對肝纖維化治療的意義，因此相關研究應注意兩者的有機統一，以全面了解疾病發病機制、治療策略及患者預后。