多重耐藥銅綠假單胞菌RND外排泵基因調控研究進展

劉瑩 費冰 任彥穎 郭夢雨 劉心偉 劉冬梅 李永偉

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一種革蘭氏陰性非發酵菌，在自然界中廣泛存在并能耐受惡劣環境，可引起各種醫院獲得性感染，包括肺炎、血流感染和囊性纖維化患者的感染，同時也是囊性纖維化患者的主要致死原因。目前，多重耐藥銅綠假單胞菌感染增加，給臨床治療帶來困難，所以迫切需要新的抗生素進行防治。銅綠假單胞菌的耐藥機制十分復雜，其中外排泵的過度表達促使抗生素從細胞內排出是導致抗生素抗菌活性降低的重要原因。銅綠假單胞菌主要產生抗藥小結分裂區（Resistance nodulation division，RND）家族和主要促進劑超家族（Major facilitator super，MFS）兩種外排泵，兩者都使用質子梯度排出底物。其中RND家族的MexAB-OprM、MexXY-OprM、MexCDOprJ和MexEF-OprN外排泵被認為是獲得性多重耐藥的主要原因[1]。現就國內外多重耐藥銅綠假單胞菌RND外排泵的研究進展進行總結，為銅綠假單胞菌的治療提供新思路。

1 RND外排泵的結構及耐藥特點

RND家族外排泵通常存在于革蘭氏陰性菌中，幾乎全部由染色體編碼，由其特有的內膜泵蛋白（如MexB）、外膜因子家族的外膜蛋白（如OprM）和膜融合蛋白家族的周質輔助蛋白（如MexA）3種成分組成[2]。周質輔助蛋白將內膜蛋白和外膜蛋白結合在一起，形成將底物排出的通道[1，3]。既往研究發現，銅綠假單胞菌中至少存在12種RND外排泵，在這些已知的RND泵中，MexAB-OprM、MexXYOprM、MexCD-OprJ和MexEF-OprN在臨床上最重要，其中MexAB-OprM和MexXY-OprM外排泵更常見，在臨床分離株中均存在過表達，尤其是在囊性纖維化患者和碳青霉烯類耐藥患者中[4]。此外，這幾類外排泵都可能對抗生素產生可誘導的、不可遺傳的耐藥性[5]。

RND類外排泵功能十分強大，能夠泵出包括抗生素和外源生物物質在內的多種物質，其導致的耐藥特點包括廣泛性耐藥、可誘導性耐藥和低水平性耐藥。廣泛性耐藥是指在包括銅綠假單胞菌在內的所有革蘭氏陰性細菌中，外排泵通過改變外膜（Outer membrane，OM）通透性并主動將抗菌藥物排出體外的一種防御機制。由于主動外排泵和OM之間的協同作用，革蘭氏陰性菌細胞膜可以非常有效地保護細菌免受抗生素的作用，同時使抗生素緩慢滲透到OM中，從而引起抗生素的有效外流。因此，主動外排泵和OM屏障的聯合作用可以保護細胞免受多種化合物的傷害。可誘導性耐藥是指外排泵機制在參與天然耐藥的同時，也可通過獲得性的誘導使外排泵表達上調從而促進主動外排，已有研究通過體外藥物誘導實驗證實PA可在低劑量、長時間抗生素作用后刺激外排泵表達上調而產生高水平耐藥[6]。低水平性耐藥是指相對于水解酶產生、靶點突變或者生物膜形成所需的最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）的升高而言，外排泵對于細菌MIC的升高是低水平的。

新型抗生素開發面臨的主要挑戰是通過改變抗生素的結構以增加其在革蘭氏陰性菌胞內的積累量，增大抗菌效率。因此，可以通過設計避免外排機制發揮作用的分子，或者使用外排泵抑制劑（Efflux pump inhibitor，EPI）抑制主動外排來減少抗生素通過OM的泵出，從而提高抗生素的作用效率[7]。

2 RND外排泵的調節機制

銅綠假單胞菌耐藥機制復雜，外排泵的表達也受多種因素影響，如群體感應系統、底物活性變化以及外排泵基因的過表達或突變，均可引起外排泵的過表達或者被抑制。4種臨床常見高表達外排泵中，MexAB-OprM、MexCD-OprJ和MexXY-OprM屬于負調節表達，分別受負調控蛋白MexR、NfxB和MexZ的調控，編碼基因位于相應外排泵編碼區上游，均與外排泵轉錄方向相反。MexEF-OprN屬于正調節表達，受正調節蛋白MexT的調控，編碼基因亦位于外排泵上游，但與之轉錄方向一致。MexXY利用MexAB系統的外膜蛋白OprM，故MexAB-OprM表達下調影響MexXY系統的表達水平，而MexABOprM、MexCD-OprJ和MexEF-OprN之間表達存在逆向關系，表明RND外排系統的調控機制和調控網絡極其嚴謹精密，各成員之間存在著極為復雜的相互關聯和作用[2]。

3 外排泵MexAB-OprM

3.1 外排泵 MexAB-OprM的作用機制 MexAB-OprM系統是RND家族藥物外排泵中發現最早、作用底物最廣泛的外排泵，其外排功能主要包括釋放抗生素以及一系列兩親分子、消毒劑、染料、溶劑或洗滌劑等外源性有毒化合物。MexAB-OprM系統在銅綠假單胞菌的獲得性耐藥中起主導作用，對多種抗生素如β-內酰胺類、β-內酰胺類抑制劑、氟喹諾酮類、四環素類、替加環素類、新霉素類、巰基內酰胺類、磺胺類、大環內酯類、氨基糖苷類等均具有外排作用[3，4]。有研究顯示，MexAB-OprM對氧氟沙星的外排是其導致銅綠假單胞菌多重耐藥的主要因素。同時，MexAB-OprM編碼基因呈組合性表達與銅綠假單胞菌的固有耐藥也密切相關。藥物試驗證實MexAB-OprM的失活可使野生株PA對多種抗菌藥物高度敏感，證明了此系統在銅綠假單胞菌固有耐藥中的重要作用[5]。此外，研究表明，MexAB-OprM泵還作用于群體感應系統（Quorumsensing system，QS系統），細菌利用QS在高細胞密度下通過產生稱為自身誘導物的信號分子來協調群體行為。銅綠假單胞菌有3個主要的相互連接的QS系統，即頂部的LAS系統、緊隨其后的RHLIR系統和假單胞菌喹諾酮信號分子（Pseudomonas quinolone signal，PQS）[6，7]。RHL系統產生的N-丁酰高絲氨酸內酯（C4-HSL）信號自由擴散到細胞外，而LAS和PQS分別產生的3-氧十二烷酰高絲氨酸內酯（3-O-C12-HSL）和PQS信號需要由膜轉運體穿過外膜輸出[8，9]。外排泵MexAB-OprM主要作用機制是運輸LAS系統產生的QS前體信號分子3-O-C12-HSL，與3-O-C12-HSL的外流有關。更多的數據表明，外排泵MexAB-OprM也能外排參與細菌群體感應的非滲透性自體誘導劑，其在內源性金屬載體分泌中的額外功能提示外排泵MexAB-OprM可能間接參與重要小分子天然化合物的分泌[10]。

3.2 外排泵MexAB-OprM的基因調控機制 外排泵MexAB-OprM調控網絡涉及多個轉錄調控因子和調節因子，包括正向調控因子MexA、CpxR和ArmR和負向調控因子MexR、AmpR、NalC、NalD、MexT和MdrR1等[11]。MexA是MexAB-OprM外排泵的周質輔助蛋白，MexA上調可以引起MexAB-OprM過表達，從而導致多藥耐藥[12]。MexR是一種由MexR基因編碼的局部抑制因子，位于MexAB-OprM操縱子的上游，MexR[13]突變通常與MexAB-OprM過表達相關。研究表明，MexR中由R70Q替換引起的MexAB-oprM的高表達是導致銅綠假單胞菌對氨曲南產生耐藥的重要因素[14]。NalC由PA3721基因編碼[15]，是TetR家族的抑制因子，負調控位于NalC下游的PA3720-PA3719操縱子。其中PA3719編碼一個僅包含53個氨基酸殘基調節因子為AmrR因子，其作為一種抗抑制因子與MexR相互作用，以變構抑制MexR控制的基因表達。AmrR的失活可將MexAB-OprM的表達降低到野生型水平，從而使多重耐藥性銅綠假單胞菌恢復敏感性。同時，NalD調控因子的氨基酸突變也可導致MexAB-OprM藥物外排泵的過度表達[16]。此外，研究表明，雙組分調節系統RocS2-RocA2也可以通過RocA2響應調節器抑制MexAB-OprM的表達。

4 外排泵MexXY-OprM

4.1 外排泵MexXY-OprM的作用機制 外排泵MexXY-OprM最主要的功能是通過主動外排胞內藥物而介導銅綠假單胞菌的天然和獲得性耐藥，可以外排氨基糖苷類、四環素類、大環內酯類、氟喹諾酮類、氯霉素、替加環素和兩性離子型頭孢菌素等抗菌藥物，從而誘導銅綠假單胞菌的耐藥。該外排泵具有底物特異性，其中氨基糖苷類是MexXY專一的特異底物。外排泵MexXY-OprM在銅綠假單胞菌野生型耐藥性表型中的作用僅限于針對核糖體的泵底物，例如核糖體靶位藥物四環素、慶大霉素、紅霉素等。與此同時在MexY周質連接槽（Periplasm-linked cleft）也有其識別區，因此MexXY還可作為MexAB-OprM的補償機制協同外排氟喹諾酮類藥物，導致該類藥物耐藥水平升高。同時高氧環境亦可誘導MexXY表達上調，囊性纖維化患者分離菌株穩定高表達MexXY，可能是細菌在局部活性氧富集環境下的應激反應。相關文獻報道MexXY-OprM也與PmrB突變體中的氨基糖苷類抗藥性有關，并通過ArmZ的抗阻遏蛋白的復雜轉錄衰減機制間接觸發操縱子MexXY的表達。編碼MexXY的TetR局部抑制子的基因MexZ的功能喪失突變是銅綠假單胞菌臨床菌株對氨基糖苷類藥物敏感性降低的常見原因。

4.2 外排泵MexXY-OprM的基因調控機制 MexXYOprM外排泵在標準實驗室條件下可被核糖體靶向制劑誘導并產生耐藥性。氨基糖苷類修飾酶（AMES）的獲得是耐藥的主要驅動因素。然而，AME的獲得與MexY的過度表達密切相關[17]。MexXY-OprM是被描述為唯一外排氨基糖苷類藥物的泵。MexY是MexXY-OprM外排泵底物特異性的決定成分。在AME和氨基糖苷類存在的情況下，由于MexXY驅動的外排活性增加，導致細胞內質子水平增加，進而影響耐藥性[17]。MexZ是MexY的負調控因子。MexXY操縱子被MexZ抑制，MexZ基因的產物與位于MexZ-MexX間隔區的反向重復區域結合，MexZ與MexZ-MexX基因間位點特異性結合，因此MexZ突變體可表現出組合性過表達MexXY-OprM[18]。同時MexXY可以對大環內酯抗生素或肽脫甲化酰酶抑制劑進行誘導。因此產生的異常多肽及其氧化修飾產物與PA5471相互作用，以此來調節MexXY。PA5471基因的破壞會損害藥物誘導的MexXY的表達，而PA5471本身同時由誘導MexXY表達的相同的核糖體靶向藥物進行誘導。體外條件下，外排泵通常在基礎水平表達，調節子和/或抑制子的突變導致這些元件的過度表達，在MDR表型的獲得和表達中起主要作用[19]。突變的調節子主要包括AcrA和AcrB，AcrA蛋白的作用主要是促進外排體系與細胞膜的融合，同時含有醛基的化合物（如肉桂醛和檸檬醛）在銅綠假單胞菌中誘導親電應激反應，刺激MexXY-OprM主動外排，增加了細菌對泵底物抗生素的耐藥性[20]。

5 外排泵MexCD-OprJ

5.1 外排泵MexCD-OprJ的作用機制 MexCD-OprJ外排泵臨床上并不常見，由于編碼MexCD-OprJ的操縱子在常規生長條件下表達水平非常低，主要參與銅綠假單胞菌的獲得性耐藥。有研究報道，由于PQS系統的前體4-羥基-2-庚基喹啉（4-hydroxy-2-heptylquinoline，HHQ）被MexCD-OprJ從菌體內排出，減少其在細菌內的積累，從而影響銅綠假單胞菌的QS系統反應，這表明PQS也可能是MexCDOprJ的底物[21]。研究表明，MexCD-OprJ外排泵的過表達可能導致銅綠假單胞菌對環丙沙星、頭孢吡肟和氯霉素的耐藥性增加，但同時由于MexCDOprJ外排泵對MexXY-OprM外排作用有一定影響，導致MexCD-OprJ外排泵對氨曲南、亞胺培南、氨芐西林和氨基糖苷類敏感性更高[22]。此外，MexD底物特異性的修飾可以誘導MexCD-OprJ的過度表達，從而損害AMpC和β-內酰胺酶的結構性表達。

5.2 外排泵MexCD-OprJ的基因調控機制 MexCDOprJ外排泵的調控主要由于外排泵膜蛋白MexC、MexD和OprJ表達上調，從而導致耐藥性的出現。消毒劑和染料可以誘導NfxB基因的突變，該基因為MexCD-OprJ外排泵的啟動子，從而導致MexCDOprJ的表達急劇增加，但這種效應不能由普通抗生素誘導產生[23]。殺菌劑、陽離子抗菌肽、洗滌劑等通過釋放膜脂成分來破壞OM和/或IM，使IM相關的Muc蛋白發出信號，使依賴AlgU的Muc-AlgU復合物極不穩定[24]。因此，AlgU變得活躍，并正向調控MexCD-OprJ的表達。此外，MexCD-OprJ的生理功能可能是從受損的細胞膜中排出相關成分。最新研究顯示，NfxB突變體中有7 bp缺失而新產生的nt213Δ7突變體，會引起銅綠假單胞菌對新型頭孢菌素-β-內酰胺酶抑制劑組合的耐藥性[25]。同時相關研究表明，MexCD-OprJ外排泵可以通過Gyr突變（主要為Gyrb突變）引起表達上調，從而導致氟喹諾酮類抗生素耐藥性提高[26]。

6 外排泵MexEF-OprN

6.1 外排泵MexEF-OprN的作用機制 MexEF-OprN外排泵可以外排環丙沙星、氯霉素和甲氧芐啶等藥物，但通常對環丙沙星顯示出低水平耐藥。主要在NfxC突變體中出現調控基因的突變引起表達上調。研究表明，MexEF-OprN外排泵的過表達可以短暫提高銅綠假單胞菌抗生素耐藥性，導致該菌從抗生素暴露中存活下來從而誘發感染[27]。對于囊性纖維化患者，MexEF-OprN外排泵過度表達可以降低相關毒力因子（鼠李糖脂、彈性蛋白酶和綠膿素等）的表達，從而降低炎癥反應，更好地促進銅綠假單胞菌的定植，使治療變得困難[28]。此外，MexEF-OprN外排泵可以誘導銅綠假單胞菌QS系統中的RHL系統表達，其調控因子MexT也可影響細菌的生長[29]。

6.2 MexEF-OprN外排泵的基因調控機制 MexEFOprN外排泵有兩種獨立的調控途徑，即MexS介導的通路和非MexS單獨介導的通路。MexS介導的MexEF-OprN的復雜調控在不同銅綠假單胞菌菌株間具有差異性。其中，MexS的單點突變可以導致MexS活性部分或完全缺失，并導致銅綠假單胞菌MexEF-OprN的顯著上調[30]。非MexS單獨介導的通路是指MexT和MexS基因的活性影響相關底物的活性，MexT是一種LysR型轉錄調控因子，位于MexEF-OprN操縱子上游，而MexS基因位于MexT上游[31]。研究表明，MexT寡聚體上第257位氨基酸的取代引起的結構變化可能會影響MexEFOprN外排泵的表達[32]。此外，GyrA中D87G突變與MexS中F7S突變引起的MexEF-OprN高表達是促使銅綠假單胞菌對環丙沙星耐藥的主要因素。GyrA的D87G突變使環丙沙星的MIC增加了4倍，而MexS中F7S突變引起的MexEF-OprN高表達使環丙沙星的MIC增加了8倍。同時研究表明，全局調控因子MvaT獨立于MexT和MexS負調控MexEF-OprN的表達。當MvaT缺失和MexEFOprN過表達后，對氯霉素和諾氟沙星的耐藥性增加，但對亞胺培南的敏感性增強[30，33]。

7 結語

由于多重耐藥銅綠假單胞菌數量的日益增長，使得攻克多重耐藥銅綠假單胞菌越發重要，主動外排機制是導致多重耐藥銅綠假單胞菌的重要因素。RND外排泵在主動外排機制中至關重要，由于其參與調節群體感應、影響毒力因子表達、生物膜形成、細菌耐藥基因突變及逆轉、細菌瞬時和持久耐藥性等。因此抑制其表達可恢復多重耐藥銅綠假單胞菌對抗菌藥物敏感性。而外排泵抑制劑主要通過競爭性抑制轉運蛋白的結合位點、干擾外排泵相關蛋白進行組合、阻斷供能效應、抑制底物通過外排泵通道等機制下調其表達，從而抑制主動外排。因此研究外排泵系統的作用機制和基因調節，通過抑制外排泵的表達，可以對多重耐藥銅綠假單胞菌提供有效的治療手段。