基于新抗原的腫瘤個體化治療研究與應用進展＊

韋樹麗 胡茫莎 王蘋莉

新抗原是一類由腫瘤細胞的突變基因編碼，經過轉錄及翻譯過程而產生的蛋白質，這些蛋白質可被抗原提呈細胞（APC）識別、吞噬、加工并遞呈于細胞表面，激活T細胞，引起效應T細胞的活化、增殖而發(fā)揮抗腫瘤作用。新抗原主要存在于腫瘤細胞，正常組織中幾乎不表達，因此針對新抗原的治療不易發(fā)生脫靶現(xiàn)象，此外由于新抗原未經過中樞免疫耐受過程，相較于腫瘤相關抗原具有更強的免疫原性，這些特點使得新抗原成為腫瘤免疫治療的優(yōu)秀靶點。基于新抗原的個體化治療正成為腫瘤免疫治療的熱點領域，本文將對近些年基于新抗原的腫瘤個體化治療的最新研究和應用進展做一介紹。

1 新抗原特異性T細胞治療

1.1 特異性腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）過繼治療

早在1980年，TIL就被發(fā)現(xiàn)具有抑制黑色素瘤轉移的能力，這也成為后續(xù)Rosenberg團隊創(chuàng)立TIL療法的理論基礎之一。TIL療法通過從切除的腫瘤標本中分離出對腫瘤細胞有反應的淋巴細胞，在體外數(shù)量級擴增后回輸給患者，從而達到抗腫瘤作用。

為了分析回輸?shù)牧馨图毎邢虬┘毎臋C制，Rosenberg團隊利用外顯子測序技術分析曾經接受TIL治療的黑色素瘤患者的腫瘤樣本，從中均篩選到了2～3個新抗原的表達，并發(fā)現(xiàn)載有新抗原的APC與TIL共孵育可引起特異性T細胞反應，這表明新抗原的存在是TIL治療有效的機制之一[1]。基于這一理論，Rosenberg團隊分析了一位經過多種化療方案均以失敗告終的晚期膽管癌患者的腫瘤標本，發(fā)現(xiàn)存在一種新抗原的表達——ERBB2IP，將對新抗原有反應的TILs體外富集使其濃度達到25%并回輸給該患者后，腫瘤病灶顯著縮小且療效維持1 年余[2]。

2016年該團隊在另一名結直腸癌肺轉移患者的腫瘤標本中分析到了KRAS突變，并獲得與該突變相關的新抗原，回輸針對該突變新抗原的TILs后，患者7處轉移灶中的6處發(fā)生消退，剩余一處病灶在經過手術切除后也未再復發(fā)[3]。KRAS基因是常見的致癌基因，大約30%的腫瘤類型包含該靶點的突變[4]，此案例的報道激起了研究者對于靶向由KRAS等熱點突變新抗原的研究熱潮。后續(xù)在上皮癌、結直腸癌、卵巢癌等腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)另一熱點突變--TP53也可以產生新抗原，并發(fā)現(xiàn)在外周血中存在對TP53有反應的特異性T細胞，且與腫瘤組織中存在的特異性T細胞的反應相近[5-8]。這與之前可以在外周血中篩選到新抗原特異性T細胞的結論一致[9]。這一發(fā)現(xiàn)為難以取得組織標本或標本量少的患者提供了另一種獲取TILs的途徑。GEN-011就是一種利用患者外周血進行新抗原特異性T細胞篩選和擴增的針對實體腫瘤的T細胞過繼療法，目前正在進行難治性實體瘤的1期臨床試驗（NCT04596033）[10]。

靶向新抗原的TIL療法具有治愈癌癥的潛力，近些年在實體瘤治療中取得了良好療效。在一項2期臨床試驗（NCT02360579）中，曾接受免疫檢查點抑制劑治療而效果不佳的晚期黑色素瘤患者經過TIL療法治療后，客觀緩解率達到了41%，疾病控制率更是達到了81%[11]。一項臨床試驗報告顯示TIL療法聯(lián)合免疫檢查點抑制劑治療頭頸部鱗狀細胞癌患者，可以達到44%的客觀緩解率及89%的疾病控制率[12]。荷蘭癌癥研究所啟動的針對TIL治療轉移性黑色素瘤的可行性研究中，一位患者在多次接受針對其突變抗原肽的TIL治療后保持無病狀態(tài)9年余[13]。

雖然部分患者對TIL治療產生良好應答，但是也存在對此療法無應答的患者。最近Steven Rosenberg和Paul Robbins團隊利用單細胞測序等技術，比較了對TIL療法有完全反應（CR）和無反應（NR）患者的TILs的表型差異，發(fā)現(xiàn)了以CD39和CD69為分群依據的兩個功能不同的細胞亞群[14]。大多數(shù)腫瘤新抗原反應性TILs處于CD39+分化狀態(tài)，而CD39和CD69雙陽性的TILs（DP TILs）為終末分化狀態(tài)，增殖潛力差。CR患者不僅存在DP TILs，還存在CD39和CD69雙陰性的TILs（DN TILs），DN TILs細胞具有干細胞樣的特征，具備自我更新、擴增的能力從而使TILs持續(xù)存在并引起腫瘤消退。同一時期，Baharom等[15]通過單細胞測序發(fā)現(xiàn)，給予新抗原疫苗后，初始T細胞將增殖分化成干細胞樣T細胞，并可進一步發(fā)育成效應性T細胞，而且在腫瘤特異性CD8+T細胞中TCF1+PD-1+“干細胞樣”細胞占了較高比例。以上的發(fā)現(xiàn)提示未來基于T細胞的免疫療法的有效開發(fā)可以通過分離和擴增具有干細胞特征的新抗原特異性T細胞來實現(xiàn)。

1.2 新抗原特異性工程化T細胞治療

工程化T細胞治療主要包括T細胞受體修飾的T細胞（TCR-T）治療和嵌合抗原受體修飾的T細胞（CAR-T）治療。傳統(tǒng)的TCR-T和CAR-T治療的靶點主要為腫瘤相關抗原，這些抗原并非腫瘤特異性，在正常細胞中也存在低水平表達，易產生脫靶效應，引起正常組織損傷[16-17]。而新抗原是由腫瘤細胞發(fā)生基因突變而產生的異常蛋白，不存在于正常細胞表面，基于新抗原的療法可以避免脫靶現(xiàn)象的發(fā)生。

2019年，Ziopharm Oncology與 MD Anderson癌癥中心宣布達成一項與Ziopharm的“睡美人”免疫療法計劃有關的新的研發(fā)協(xié)議，該協(xié)議旨在使用非病毒基因轉移來穩(wěn)定表達和臨床評估T細胞中的新生抗原特異性T細胞受體（TCRs）。美國國家癌癥中心最近開展了鑒定及使用新生抗原特異性TCRs治療多種實體瘤的臨床試驗（NCT03412877）。PACT制藥公司則通過預測新抗原，篩選反應性T細胞并分析其受體信息及慢病毒轉染T細胞來構建neoTCR-P1細胞深層儲存庫，在臨床前研究中，這些經過改造的T細胞被證明可殺死表達突變抗原的腫瘤[18]。

新生抗原特異性TCRs治療或將成為個性化腫瘤特異性免疫治療的新方法，但由于每個患者的突變都具有獨特性，尋找個性化的T細胞，測序克隆相關的TCRs并實現(xiàn)細胞轉染，這整個過程中的時間和及經濟的消耗將是TCR-T推廣和量產所面臨的挑戰(zhàn)之一。

2 基于新抗原的雙特異性抗體療法

雙特異性抗體是含有兩種特異性抗原結合位點的人工抗體，可以聯(lián)通靶細胞和功能分子/細胞，激發(fā)具有導向性的免疫反應，在腫瘤的免疫治療中具有廣闊的應用前景[19]。近日，由約翰-霍普金斯大學學者領銜的研究團隊成功研發(fā)出靶向熱點突變——RAS和p53突變體的雙特異性抗體，該抗體的一臂靶向癌細胞表面的由突變的RAS或TP53基因所編碼的蛋白質，另一臂與T細胞受體（通常為CD3）結合，橋接并激活免疫細胞以攻擊腫瘤細胞[20-21]。研究結果表明該雙特異性抗體能夠顯著抑制腫瘤的生長。但是雙特異性抗體缺少Fc段，穩(wěn)定性不高，后續(xù)還需進一步優(yōu)化改造[22]。

3 基于新抗原的個體化疫苗治療

2012年Sahin團隊首次通過二代測序（NGS）技術在小鼠黑色素瘤細胞系B16F10中篩選到數(shù)個具有免疫原性的新抗原，將基于新抗原設計的多肽疫苗與佐劑一起對黑色素瘤小鼠進行皮下注射后，小鼠腫瘤的生長速度比接受單純佐劑注射組及未接受任何治療組顯著減緩，且在數(shù)月后，仍有40%的小鼠存活。若先將新抗原疫苗免疫小鼠，再經黑色素瘤造模后，小鼠腫瘤生長的速度同樣減慢，表明新抗原疫苗具有治療和預防的雙重價值[23]。2014年，Gubin等[24]使用基因組學和生物信息學方法來鑒定腫瘤特異性突變蛋白，以此設計的長肽疫苗在治療患有進行性生長肉瘤的小鼠中發(fā)揮了強大的抗腫瘤效應，顯示高應答率。良好的臨床前研究結果掀起了基于新抗原的腫瘤個體化疫苗的臨床研究熱潮。

2015年，基于新抗原的樹突狀細胞（DC）疫苗首次進行人體試驗，3位黑色素瘤患者在接受疫苗接種后，其抗腫瘤免疫的抗原廣度和克隆多樣性均有所擴大[25]。而在2017年，德國Sahin團隊和美國Wu團隊主導的兩個Ⅰ期臨床試驗更是證明基于新抗原的腫瘤個體化疫苗可以引起強大的抗瘤效應和較低的副作用，能帶來直接的臨床獲益，這相較于此前的個案報道更具說服力[26-27]。兩個臨床試驗納入的研究對象均是中晚期黑色素瘤患者，均為復發(fā)高危人群。13名患者接受了Sahin團隊mRNA個體化疫苗治療，其中8位患者在23個月內無疾病復發(fā)，另外5位患者在接受疫苗之前已發(fā)生疾病進展，在接受治療后有2位獲得了客觀應答，其中1位獲得了完全緩解，且26個月無復發(fā)，另1位在疫苗的序貫治療和抗PD-1抗體治療后腫瘤完全消退[26]。Wu團隊則招募了10位高危黑色素瘤術后患者，通過全基因組測序，比較每位患者的癌細胞和正常細胞之間的基因差異，確定每位患者的基因突變情況，根據不同的基因突變情況為每位患者制定針對多達20種腫瘤新抗原的個體化癌癥疫苗，最終有6位患者接受了完整的個體化抗癌疫苗（NeoVax疫苗）治療。25個月的中位隨訪時間內，4例ⅢB/C期患者無復發(fā)，復發(fā)的2例ⅣM1a/b期（肺轉移）患者經4個療程的抗PD-1治療后，獲得了完全緩解[27]。更為有趣的是，該團隊在對這6位患者及當時新入組的2名患者進行隨訪的4年多的時間中，8名患者全部存活，其中3名患者未復發(fā)，復發(fā)的5名患者中，2名Ⅳ期患者受抗PD-1單抗治療后完全緩解，1名患者接受了手術切除后未發(fā)現(xiàn)疾病證據，2名患者發(fā)展為不可切除的轉移性疾病。對這些患者的T細胞進行分析后，研究者發(fā)現(xiàn)患者的TCR譜系的多樣性隨著疫苗的多次注射而不斷得到擴展，T細胞對大多數(shù)新抗原的反應在接種后可以維持到4.5年，而且這些患者體內還產生了靶向其他新抗原（非NeoVax疫苗抗原）的特異性T細胞[28]。這一長期隨訪的試驗結果表明：個體新抗原疫苗可以刺激黑色素瘤患者產生持久的免疫應答。

德美兩個團隊在黑色素瘤中得到肯定的試驗結果后，又將目標轉向了膠質母細胞瘤[29-30]。研究者通過單細胞TCR分析技術發(fā)現(xiàn)經過新抗原疫苗治療后，來自外周血的新抗原特異性T細胞可以遷移聚集到顱內膠質母細胞瘤中[29]。由此證明，新抗原靶向疫苗可能有力地改變膠質母細胞瘤的免疫環(huán)境。近日，Michael Platten團隊用靶向腦膠質瘤IDH1突變的腫瘤疫苗治療了32例患者，總體反應率達84.4%，3年無進展率和無死亡率分別為63%和84%[31]。此外，個體新抗原疫苗單藥或聯(lián)合免疫檢查點抑制劑在非小細胞肺癌、卵巢癌、胃癌、結直腸癌、晚期集合管癌、胰腺癌中也展現(xiàn)出良好的治療效果[32-36]。2020年，Chen教授團隊在國際上發(fā)表了首個基于新生抗原個體化多肽疫苗單藥治療泛癌中晚期實體瘤患者的臨床試驗，結果顯示該類疫苗疾病控制率高，且明顯延長晚期腫瘤患者的生存期[36]。

4 展望

生物信息學工具、基因組大數(shù)據和計算機算法的發(fā)展，納米材料等新載體的開發(fā)推動了新抗原的研究與應用，使得腫瘤的治療方式向著個體化和精準化的方向發(fā)展。目前基于新抗原的腫瘤個體化治療的研究主要集中于新抗原疫苗及靶向新抗原的TIL回輸，雖然相關的臨床試驗大部分處于Ⅰ期或Ⅱ期階段，但是已有結果表明這是極具潛力的治療方案。而且相較于免疫檢查點抑制劑單藥使用，其與基于新抗原的個體化治療方案聯(lián)用顯著延長了部分患者的生存期，類似的試驗結果在EGFR靶向治療聯(lián)合新抗原疫苗中也有體現(xiàn)。此外，臨床研究也顯示，高的新抗原負荷與免疫檢查點抑制劑治療腫瘤的臨床持久獲益相關，提示新抗原不僅具有作為治療靶點的作用，還具有預測臨床預后的潛力，相信其在未來臨床應用中將大放異彩[37-38]。