高效液相色譜—熒光法檢測雞蛋中氟喹諾酮類藥物的殘留量

韋 偉，劉付祥，王文濤

(清鎮市農產品質量檢測站/清鎮市農業產業服務中心/清鎮市農業廣播電視學校，貴州 清鎮 551400)

氟喹諾酮類藥物(FQS)是第3代哇諾酮藥物，主要包括恩諾沙星(ENR)、達氟沙星(DAN)、環丙沙星(CIP)、沙拉沙星(SFX)等。由于養殖行業對農產品質量安全的責任意識不強，存在部分違規使用獸藥、抗生素及違禁藥品和不嚴格執行休藥期規定等諸多問題，使得動物性產品中獸藥殘留超標[1-2]。生活中，當過多食用含有藥物殘留的動物性食品后，通常不表現為急性毒性，而是藥物在人體不斷蓄積，對人體神經系統、消化系統、泌尿系統等多個系統造成損害[3]，更容易誘導人類致病菌對其耐藥性的增強，不利于該類藥物對人類疾病的治療[4]。農業部于2002年已發布第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規定環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星在雞蛋中不得檢出。因此，不斷提高食品安全監管能力和水平，利用有效檢測技術測定動物性食品中獸藥殘留，對堅決捍衛人民群眾舌尖上的安全尤為重要。

近年來，國內外已有諸多有關FQS殘留在動物組織中的測定方法的報道[5-8]。主要有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)及酶聯免疫分析法(ELISA)等。其中，HPLC法具有應用范圍廣、分離能力強、檢測工作成本低、樣品易回收等特點，在實際工作中更具推廣性和實用性，但因儀器設備、環境條件等不同導致相關測定方法與行業標準偏離較大，且回收率不穩定。因此，本試驗針對縣級檢驗檢測機構常用的《農業部781號公告-6-2006 雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量的測定 高效液相色譜法》檢測過程進行優化，通過標準曲線、回收率試驗、檢出限試驗和精密度試驗等，以期為雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量的測定提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

試驗主要儀器設備：高效液相色譜儀(UiMate3000-FLD，Thermo Scientific，美國)、酸度計(PHS-3C，上海)、高速離心機(Thermo Scientific,美國)、組織勻漿器(Equl-kinematica，瑞士)、固相萃取柱(300 mg/mL)、有機濾膜(0.22 μm)及電子天平(0.01 g)等。

1.2 試劑材料

環丙沙星(C17H18FN3O3)、達氟沙星(CI9H20FN3O3)、恩諾沙星(C18R20FN3O3)、沙拉沙星(C20R17F2N3O3)標準樣品，標準值均為100 μg/mL(農業部環境保護科研監測所)；乙腈(色譜純，美國BCR色譜試劑)、三乙胺(純度≥99.0%，廣東)、磷酸二氫鉀(分析純，純度≥85.0%，北京)。

1.3 色譜條件

色譜柱：Thermo C18柱，參數4.6×250 mm。檢測波長：激發波長280 nm；發射波長450 nm。流速：1.0 mL/min。柱溫：35 ℃。進樣量：20 μm。流動相：0.05 mol/L磷酸/三乙胺溶液-乙腈(81+19),使用前過0.22 μm濾膜。

1.4 樣品制備

按標準稱取樣品(2±0.05)g，置于勻漿杯中，加提取液磷酸2.0 mL，攪勻振蕩10 min，5000 r/min 離心10 min。取上清液立即轉入另一離心管中。再用提取液磷酸鹽2.0 mL重復提取一次，洗殘渣，攪勻，振蕩和離心。然后，合并兩次提取的上層清液于同一離心管中，加入水飽和的正己烷10 mL，振蕩5 min，5000 r/min離心10 min，用吸管將上層正己烷絮凝狀固體仔細吸凈棄去，在下層溶液中再次加入水飽和正己烷10 mL，振蕩，離心。同樣，再棄去上層正己烷，下層為備用液。然后，將C18固相萃取柱(300 mg/mL)安裝于固相萃取裝置，并依次用乙腈5 mL,乙腈(30%)-緩沖液5 mL和磷酸鹽提取液5 mL潤洗過柱，取備用液全部過柱，再用水5 mL過柱沖洗。加1 mL流動相洗脫過柱，收集洗脫液作為試樣溶液，溶液過濾膜(0.25 μm)后供高效液相色譜分析。試驗中，對《農業部781號公告-6-2006雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量的測定 高效液相色譜法》檢測過程進行優化，磷酸取液體積調整為20 mL,分兩次提取；備用液過柱分取5 mL；流動相洗脫過柱的流動相中乙腈比例調整為35%。

1.5 結果計算

2 結果與分析

2.1 樣品提取與凈化

本試驗結合農業部781號公告-6-2006雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量的測定方法，并在前期的"雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量檢測方法"相關研究報道基礎上[9-12]，進一步提高環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星的檢測靈敏度繼續進行方法確認和驗證。研究表明，多數喹諾酮類在C-3含有酸性的羧基，C-7位連接有含氮堿性的哌嗪基等，屬酸堿兩性化合物，易溶于酸性或堿性溶劑，通過實驗對比甲醇、乙腈和磷酸鹽三種提取液，磷酸鹽提取液雜質少、回收率高，效果最佳[10]。此次試驗，結合相關研究成果以及實驗室試驗研究，對農業部781號公告-6-2006雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量的測定方法前處理中提取液體積、備用液分取體積和洗脫液中乙腈的比例進行了研究試驗。樣品前處理中，提取液體積分別量取2 mL和10 mL磷酸鹽提取液重復2次提取；備用液分取體積分別為全部和分取5 mL過柱；洗脫液體積分別量取1 mL的乙腈(19%)-緩沖液和1 mL的乙腈(35%)-緩沖液洗脫開展對比試驗。結果表明，按照農業部781號公告-6-2006檢測方法磷酸提取液4 mL、備用液全部過柱和乙腈(19%)-緩沖液洗脫的處理方法添加回收率只能達到25.12%～36.20%；優化后的20 mL磷酸提取液，備用液分取5 mL過柱和乙腈(35%)-緩沖液洗脫的處理方法添加回收率提高50%以上，達到90.40%～96.15%，氟喹諾酮類藥物殘留量的測定回收率得到大幅度提升。

2.2 校準曲線與線性范圍

校準曲線的數學方程式以及校準曲線的工作范圍，濃度范圍盡可能覆蓋一個數量級，至少作5個檢測點(不包括空白)。此次試驗，結合實驗室經驗積累以及操作便利性對農業部781號公告-6-2006檢測方法中校準曲線梯度做了優化。精確量取適量100 μg/mL環丙沙星、恩諾沙星和沙拉沙星標準工作液，用流動相稀釋成濃度為5、10、 20、100、500 ng/mL的環丙沙星、恩諾沙星和沙拉沙星標準溶液，精確量取適量達氟沙星標準工作液，用流動相稀釋成濃度為1、2、4、20、100 ng/mL達氟沙星標準溶液。供高效液相色譜分析(強制過原點)。由表1可知，4種喹諾酮類藥物的回歸方程(強制過原點)及相關系數，在5～500 ng/g 范圍內線性良好，其中達氟沙星為1～100 ng/g,相關系數R2均達到0.9999以上。

表1 喹諾酮類藥物的回歸方程、相關系數Tab.1 Regression equation and correlation coefficient of quinolones

2.3 方法準確度、回收率和檢出限

此次試驗，取適量試樣添加溶液和相應的標準工作溶液，作多點校準，以色譜峰面積積分值定量。標準工作液及試樣溶液中的環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星和沙拉沙星響應值均應在儀器檢測的線性范圍之內。采用標準添加法，在空白雞蛋樣品中添加10 ng/mL的環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星進行回收率試驗，平行試驗2個。在上述色譜條件下，藥物的出峰先后順序依次為環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星和沙拉沙星，空白溶液、標準溶液和試樣添加溶液的液相色譜圖見圖1、圖2和圖3。由此可見，4種氟喹諾酮類藥物分離效果好，基線平滑，峰形尖銳，對稱性好，且經計算回收率均達到了90%以上(表2)，相對標準偏差均小于等于10%。通過優化后的前處理方法，在標準色譜條件下，藥物不同濃度樣品試驗，以信噪比S/N=3確定檢出限。結果表明，環丙沙星、恩諾沙星和沙拉沙星檢出限為5 ng/mL，達氟沙星檢出限為1 ng/mL。

圖1 雞蛋試樣中空白樣品色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of blank sample in eggs

圖2 氟喹諾酮類藥物混合標準品色譜圖(20 ng/mL,4 ng/mL)Fig.2 Liquid chromatogram of Fluoroquinolones mixed standard substances

圖3 雞蛋中空白添加樣品色譜圖(10 ng/mL,2 ng/mL)Fig.3 Liquid chromatogram of blank addition sample eggs

表2 雞蛋中4種氟喹諾酮類藥物添加回收率(補充每個重復的回收率)Tab.2 Additive recovery of 4 fluoroquinolones in eggs

3 結論與討論

此研究針對縣(市)級農產品質量安全檢驗檢測機構常用的檢測標準《農業部781號公告-6-2006 雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量的測定—高效液相色譜法》[16]進行方法優化，在最大限度遵循該參考標準基礎上進行了研究試驗，并參考了近年來國內外諸多有關氟喹諾酮類藥物殘留在動物組織中的測定方法的報道[13-16]。經試驗研究發現，標準中提取條件、色譜條件等影響因子不變，僅需對標準中關鍵部分優化，即校準曲線濃度梯度、磷酸鹽提取液體積調整為20 mL，洗脫液調整為乙腈(35%)-緩沖液，在UiMate3000-FLD高效液相色譜儀分析下雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量的添加回收率達到90%以上，符合縣(市)級檢驗檢測機構對動物性食品(雞蛋)中氟喹諾酮類藥物殘留量的測定要求。