同時(shí)檢測(cè)H5和N8亞型AIV雙重納米PCR方法的建立和應(yīng)用

李 丹，李 孟，謝芝勛，羅思思，張民秀，謝麗基，黃嬌玲，華 俊，粟永春，阮志華

（1.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001；2.廣西金陵農(nóng)牧集團(tuán)有限公司，廣西 南寧 530049）

禽流感（Avian influenza，AI）是一種由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的禽類(lèi)傳染性病毒病［1］。AIV具有亞型多、傳染性強(qiáng)和分布廣且具有一定的宿主特異性且變異快的特點(diǎn)［2-5］。依據(jù)AIV對(duì)雞致病力的不同，AIV可分為高致病性禽流感病毒（HPAIV）和低致病性禽流感病毒（LPAIV），HPAIV引起的禽類(lèi)感染死亡率極高，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［6-8］。能引起HPAI發(fā)生的主要是H5和H7亞型AIV，其中影響最大的是H5亞型HPAIV。目前，H5亞型AIV已在60多個(gè)國(guó)家的家禽和野鳥(niǎo)中被檢測(cè)出，包括H5N1、H5N2、H5N3、H5N5、H5N6和H5N8等組合，而且該亞型組合的病毒還在不斷地進(jìn)化和變異［9-10］。近年來(lái)，H5N8亞型AIV作為其中一個(gè)重要亞型組合，逐漸引起了人們的關(guān)注。1983年H5N8疫情首次在冰島發(fā)生過(guò)流行，中國(guó)于2010年首次在家禽中檢測(cè)出H5N8亞型AIV［11］。2014年初在韓國(guó)和日本的家禽中發(fā)現(xiàn)該亞型AIV，并傳播至歐洲和北美洲［12-13］。2020年以來(lái)，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）通報(bào)發(fā)現(xiàn)，沙特阿拉伯和匈牙利等國(guó)家的家禽中再次暴發(fā)了H5N8亞型AI，并蔓延至其他國(guó)家［14-15］。2020年12月，國(guó)際上首次報(bào)告俄羅斯養(yǎng)殖場(chǎng)工作人員感染H5N8亞型AIV的病例［16］。H5N8禽流感病毒在亞歐大陸和非洲大流行，已成為影響全球家禽養(yǎng)殖、野生動(dòng)物安全的一個(gè)重要因素。同時(shí)，新發(fā)生的H5N8禽流感病毒可造成人感染，已成為值得關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題，須引起高度重視。因此，建立能迅速、有效地鑒別H5和N8亞型禽流感病毒的檢測(cè)方法，對(duì)禽流感的防控及保障人類(lèi)公共衛(wèi)生安全具有十分重要的意義。

目前，病毒分離鑒定是診斷AIV感染的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，由于AIV亞型眾多且新的變異株不斷出現(xiàn)，采用傳統(tǒng)方法對(duì)其進(jìn)行分型和診斷，不僅存在著操作方法復(fù)雜，而且檢測(cè)周期長(zhǎng)、容易受抗體等因素影響，使得檢測(cè)結(jié)果不能準(zhǔn)確和及時(shí)地判斷［17-18］。AIV分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要包括RT-PCR和熒光定量PCR等方法，納米PCR技術(shù)是近年來(lái)新興起的一種將納米技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的核酸檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)在改善PCR反應(yīng)特異性和敏感性等諸多方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，可以有效地提高PCR檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性［19-21］。隨著科學(xué)技術(shù)日新月異地發(fā)展，人們不斷地改良和優(yōu)化納米PCR檢測(cè)方法并擴(kuò)展至其他應(yīng)用領(lǐng)域。目前，納米PCR技術(shù)在動(dòng)物疫病檢測(cè)領(lǐng)域已經(jīng)有一些報(bào)道［22-25］，而雙重納米PCR（nano-dPCR）技術(shù)的反應(yīng)體系能同時(shí)擴(kuò)增H5和N8基因并用于檢測(cè)和鑒別H5N8亞型AIV的核酸檢測(cè)技術(shù)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究旨在建立一種同時(shí)檢測(cè)H5和N8亞型AIV的雙重納米PCR方法，以期為監(jiān)測(cè)H5亞型和N8亞型AIV的流行情況及其鑒別診斷提供新的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 納米PCR試劑盒（NPK02）購(gòu)自上海滬崢生物科技有限公司；DNA/RNA共提試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞、PCR產(chǎn)物快速連接載體和DNA Marker均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；購(gòu)自寶生物（北京）有限公司的試劑有M-MLV、隨機(jī)引物、dNTP、RNA抑制劑。其他試劑均購(gòu)自商業(yè)公司。PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司，超微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，實(shí)驗(yàn)所用SPF雞胚購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 毒株 毒株（H1N2、H3N2、H4N2、H6N8、H6N1、H9N2、NDV、IBV、ARV、ILTV和ChPV）均由廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；H7N2、H13N6、H14N5、H16N3和H15N9亞 型AIV的cDNA模板由美國(guó)賓夕法尼亞州立大學(xué)惠贈(zèng)；H5N1和H5N2亞型AIV的cDNA模板由美國(guó)康涅狄格州立大學(xué)惠贈(zèng)；其他AIV（H2N3、H8N4、H10N3、H12N5和H11N3）毒株或cDNA模板均由香港大學(xué)惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 運(yùn)用DNAStar軟件，將GenBank中下載的N8亞型AIVNA和H5亞 型AIVHA基因的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，分別對(duì)2種目的基因進(jìn)行特異性保守區(qū)域的篩選，采用Primer 6.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，并通過(guò)NCBI BLAST在線驗(yàn)證其特異性，篩選出分別針對(duì)2種目的基因的2對(duì)特異性引物。設(shè)計(jì)出的引物序列見(jiàn)表1。上述引物均由華大基因廣州分公司合成。

表1 H5和N8亞型AIV HA和NA基因的引物序列

1.2.2 病毒RNA/DNA的提取與RNA的反轉(zhuǎn)錄 參照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，運(yùn)用DNA/RNA抽提試劑盒對(duì)實(shí)驗(yàn)中所用到的AIV、NDV、IBV、ARV和ILTV的DNA/RNA進(jìn)行抽提，并用DEPC水溶解抽提后的DNA/RNA。參照反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)，對(duì)RNA病毒的抽提產(chǎn)物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，所有DNA和cDNA產(chǎn)物均置于-30 ℃冰箱中保存。

1.2.3 雙重納米PCR反應(yīng)體系及其條件的優(yōu)化 nanodPCR方法的PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×Nano-QPCR buffer 12.5 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.5 μL，作為模板N8亞型AIV和H5亞型AIV的cDNA各加入1 μL；再分10個(gè)梯度各加入0.1～1.0μL對(duì)引物H5-F、H5-R、N8-F和N8-R（25 pmol/μL）進(jìn)行引物濃度的優(yōu)化；最后，用超純水將反應(yīng)總體積補(bǔ)足至25 μL。為最終確定最佳的反應(yīng)體系及條件，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)退火溫度和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 特異性實(shí)驗(yàn) 為驗(yàn)證所建立的nano-dPCR檢測(cè)方法的特異性，按照優(yōu)化后的條件，用該法對(duì)H1N2、H2N3、H3N2、H4N2、H5N1、H5N2、H6N8、H6N1、H7N2、H8N4、H9N2、H10N3、H11N3、H12N5、H13N6、H14N5、H15N9、H16N3、NDV、IBV、ILTV和ARV進(jìn)行特異性擴(kuò)增，檢驗(yàn)其特異性。對(duì)擴(kuò)增出的目的片段進(jìn)行純化和回收，PCR產(chǎn)物快速連接至載體上，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行克隆，挑選陽(yáng)性單克隆菌送賽默飛廣州分公司進(jìn)行測(cè)序和驗(yàn)證。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 分別以N8亞型AIV與H5亞型AIV的cDNA為模板，用特定的引物對(duì)N8亞型AIVNA和H5亞型AIVHA基因的全長(zhǎng)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到其N(xiāo)8亞型AIVNA和H5亞型AIVHA基因的全長(zhǎng)目的片段，再分別將2個(gè)基因片段連接到PCR產(chǎn)物快速連接載體中，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行克隆，挑選陽(yáng)性單克隆菌送華大基因廣州分公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將含有N8亞型AIVNA和H5亞型AIVHA基因片段的2種重組質(zhì)粒分別命名為N8-T和H5-T。分別提取N8-T和H5-T的質(zhì)粒，并用微量核酸檢測(cè)儀對(duì)其進(jìn)行核酸濃度的測(cè)定，根據(jù)分子質(zhì)量和核酸濃度計(jì)算對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)，將N8-T和H5-T等拷貝數(shù)混合，并稀釋10倍，以得到N8-T和H5-T質(zhì)粒DNA濃度均為5× 100～5×109拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.6 敏感性實(shí)驗(yàn) 為檢測(cè)該方法的敏感性，運(yùn)用所建立的H5和N8亞型禽流感病毒雙重普通PCR（dPCR）和nano-dPCR的檢測(cè)方法，同時(shí)對(duì)N8-T和H5-T質(zhì)粒濃度為5×100～5×109拷貝/μL的樣品進(jìn)行特異性擴(kuò)增，并比較這2種方法的敏感性。

1.2.7 臨床樣品檢測(cè) 對(duì)活禽市場(chǎng)采集的130份家禽咽喉及泄殖腔拭子樣品運(yùn)用建立的nano-dPCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)和鑒定，同時(shí)將樣品處理后接種SPF雞胚進(jìn)行病毒分離鑒定，將病毒分離鑒定結(jié)果與nano-dPCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較；然后將陽(yáng)性樣品進(jìn)行HA和NA基因全長(zhǎng)擴(kuò)增，并將HA和NA基因全長(zhǎng)克隆送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序和分析，以驗(yàn)證nano-dPCR檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙重納米PCR方法的建立

通過(guò)nano-dPCR方法分別對(duì)H5亞型AIV和N8亞型AIV的目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可分別獲得207和428 bp的特異性目的片段（圖1），與預(yù)期片段大小相符。

圖1 H5和N8亞型AIV目的基因nano-dPCR擴(kuò)增圖譜

2.2 H5亞型和N8亞型AIV nano-dPCR檢測(cè)方法的最佳退火溫度和最佳反應(yīng)條件的確定

H5亞型和N8亞型AIV nano-dPCR經(jīng)退火溫度（46～53 ℃）優(yōu)化，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，49～50 ℃下nano-dPCR擴(kuò)增效果均表現(xiàn)為良好，最終選擇50 ℃為nano-dPCR檢測(cè)方法的最佳退火溫度。nano-dPCR方法的PCR最佳反應(yīng)體系為25 μL：2×Nano-QPCR buffer 12.5 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.5 μL，作為模板N8亞型AIV和H5亞 型AIV cDNA各 加 入1 μL，引 物H5-F和H5-R（25 pmol/μL）0.8 μL、引物N8-F和N8-R（25 pmol/μL）1.2 μL，加ddH2O補(bǔ)足25 μL。最終優(yōu)化的反應(yīng)條件為：94 ℃、3 min；進(jìn)入94 ℃、20 s，50 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共30個(gè)循環(huán)；然后，再72 ℃延伸5 min，最后，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。

圖2 nano-dPCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果

2.3 特異性實(shí)驗(yàn)

在H5、N8亞型AIV擴(kuò)增結(jié)果中出現(xiàn)2條特異性條帶，分別為207和428 bp；在H5N2亞型AIV即H5Ny（y≠8）亞型AIV擴(kuò)增結(jié)果中僅出現(xiàn)1條特異性條帶，片段大小為207 bp；在H6N8亞型AIV即HxN8（x≠5）亞型AIV擴(kuò)增中僅出1條特異性條帶，片段大小為428 bp。對(duì)其他亞型AIV以及常見(jiàn)的禽病病原體的擴(kuò)增中均未出現(xiàn)條帶（圖3），由此表明nano-dPCR檢測(cè)方法的特異性良好。

圖3 特異性擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 敏感性實(shí)驗(yàn)

以初始濃度均為5×109拷貝/μL的H5-T和N8-T，經(jīng)過(guò)ddH2O 10倍系列的稀釋?zhuān)∶總€(gè)稀釋度的重組質(zhì)粒模板進(jìn)行nano-dPCR和dPCR檢測(cè)。敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：nano-dPCR可檢測(cè)H5亞型AIVHA和N8亞型AIVNA基因的最低拷貝數(shù)均為5×102拷貝/μL；而使用dPCR方法檢測(cè)的最低拷貝數(shù)均為5×104拷貝/μL（圖4）。nano-dPCR檢測(cè)方法的敏感性比dPCR檢測(cè)方法高100倍。

圖4 H5和N8亞型AIV nano-dPCR和dPCR敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 臨床樣品檢測(cè)

運(yùn)用該方法對(duì)廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從南寧活禽市場(chǎng)采集的130份雞口腔及泄殖腔棉拭子品進(jìn)行檢測(cè)。樣品nano-dPCR檢測(cè)的結(jié)果顯示：6份樣品能擴(kuò)增出478 bp的目的條帶，為H5NxAIV，陽(yáng)性率為2.31%；15份樣品能擴(kuò)增出428 bp的目的條帶，為HyN8 AIV，陽(yáng)性率為11.54%；所有樣品同時(shí)接種SPF雞胚進(jìn)行病毒分離，病毒分離結(jié)果與nano-dPCR方法檢測(cè)結(jié)果完全一致。nanodPCR獲得的產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示，nano-dPCR獲得的207、428 bp特異片段分別與H5亞型AIVHA、N8亞型AIVNA基因序列的符合率均為100%。

3 討論

近年來(lái)，由于不同組合H5亞型AIV感染引發(fā)的高致病性禽流感疫情持續(xù)出現(xiàn)，已經(jīng)威脅家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，并引發(fā)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生危機(jī)［26-27］。另外，某些N8亞型AIV（例如H10N8、H3N8和H5N8等）還能直接感染人類(lèi)，對(duì)人類(lèi)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅［28-29］。由于不同亞型禽流感病毒感染家禽后的臨床癥狀、剖檢病變極其相似，肉眼和常規(guī)的方法難以對(duì)其進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒別診斷。普通PCR在臨床檢測(cè)上比較常用，雖然實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的敏感性比普通PCR高，但需要昂貴的精密儀器且操作程序復(fù)雜。納米技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，隨著對(duì)納米材料在PCR反應(yīng)過(guò)程中作用機(jī)制的深入研究，更多研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了檢測(cè)不同動(dòng)物疫病的納米PCR技術(shù)［30］。目前，納米PCR已成功應(yīng)用于感染豬、牛、雞、犬和貓等多種動(dòng)物病原的臨床檢測(cè)中［31-32］，上述研究所建立的納米PCR檢測(cè)方法靈敏度均比普通PCR檢測(cè)方法的高，且特異性更好。

前期納米PCR的研究多集中在對(duì)單一病原檢測(cè)方法的研究。近年來(lái)，多重納米PCR逐漸成為研究熱點(diǎn)。在多重PCR反應(yīng)體系中，引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，它是決定多重PCR反應(yīng)成功與否的關(guān)鍵。本研究在引物設(shè)計(jì)時(shí)，充分平衡各種影響多重PCR的因素，同時(shí)將擴(kuò)增H5亞型AIVHA和N8亞型AIVNA基因的引物，進(jìn)行多個(gè)引物組合的比對(duì)和篩選優(yōu)化，并依據(jù)長(zhǎng)期的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，選擇最佳的引物對(duì)組合進(jìn)行nano-dPCR擴(kuò)增，為nano-dPCR方法的成功建立奠定了基礎(chǔ)。退火溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：nano-dPCR產(chǎn)物在49～50 ℃的低退火溫度條件下均能得到很好的擴(kuò)增，在增加PCR產(chǎn)物量的同時(shí)，避免了引物間的非特異性擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)對(duì)所獲得的特異性PCR產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序和比對(duì)分析，結(jié)果表明：nano-dPCR擴(kuò)增獲得了預(yù)期片段大小一致的特異條帶，且測(cè)序結(jié)果與所設(shè)計(jì)基因片段高度一致。敏感性實(shí)驗(yàn)對(duì)比的結(jié)果表明，nano-dPCR的最低核酸檢測(cè)量比普通dPCR最低核酸檢測(cè)量高100倍，與其他研究者的結(jié)果基本一致［33］，表明本研究建立的nano-dPCR反應(yīng)具有良好的敏感性。

應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)所建立的nano-dPCR對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，N8亞型AIV的感染率為11.54%，H5亞型AIV感染率為2.31%。由檢測(cè)結(jié)果可知，N8亞型AIV在雞群中存在普遍感染，N8亞型AIV的陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于H5亞型AIV的陽(yáng)性率。此外，在本次檢測(cè)中未出現(xiàn)了H5亞型AIV和N8亞型AIV的混合感染現(xiàn)象，這提示在禽流感防控的過(guò)程中，應(yīng)該對(duì)H5亞型AIV和N8亞型AIV給予關(guān)注。

4 結(jié)論

本研究成功地建立了能同時(shí)檢測(cè)H5亞型和N8亞型的雙重納米PCR檢測(cè)方法，該方法具有比普通PCR方法靈敏性更高，又比實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法更簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，更有利于在基層推廣應(yīng)用，為H5亞型和N8亞型AIV的臨床檢測(cè)及防控提供了新的技術(shù)支撐。