美洲大蠊和德國小蠊腸道內生真菌的分離鑒定及拮抗昆蟲病原真菌的初步研究

樂倩倩，鈕徐融，謝永輝，劉全俊，詹莜國，柯昌磊，李微杰，張 倩，張心雨，張瑞玲，張 忠，王志江*

（1.云南省煙草公司 昆明市公司，云南 昆明 650051；2.山東第一醫科大學(山東省醫學科學院) 基礎醫學院，山東 泰安 271016；3.云南農業大學 植物保護學院，云南 昆明 650201）

美洲大蠊（Periplaneta american）和德國小蠊（Blattella germanica）屬于節肢動物門昆蟲綱蜚蠊目，長期滋生在下水道、化糞池以及居民生活區的排污管等處，擁有超強的繁殖能力和抗病性，甚至會對常用殺蟲劑產生耐藥［1］。昆蟲病原真菌生物制劑，作為一種安全、高效、持效期長且不易產生抗藥性的生物防治手段，逐漸引起了人們的高度重視。但有研究表明蟑螂體內的某些共生菌能幫助其抵抗蟲生真菌的感染。德國小蠊體內，尤其是腸道內有多種內共生菌［2］，這些內共生微生物是昆蟲正常生長發育所必需的，不僅參與昆蟲維生素合成吸收、脂肪和糖類利用以及氮循環，而且在抵抗外來病原微生物的入侵、定殖以及免疫系統的加強中起著至關重要的作用［3-4］。如從德國小蠊腸道中分離的細菌菌株Bacillus subtilis［5］和Pseudomonas reactans［6］不僅能夠抑制白僵菌分生孢子的萌發，而且能夠抑制菌絲的生長，具有抗白僵菌感染活性。目前，針對蟑螂腸道真菌抗常見昆蟲病原真菌感染的反應研究未見報道。本研究從美洲大蠊和德國小蠊體內分離獲得了16種真菌菌株，通過平板對峙法從中篩選出對常見昆蟲病原真菌——球孢白僵菌（Beauveria bassiana）和萊氏野村菌（Nomuraea rileyi）具有拮抗作用的菌株，為探討2種蜚蠊對常見昆蟲病原真菌的抗病機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源

美洲大蠊和德國小蠊種群均來自濟南市疾病預防控制中心引種，于2005年在山東第一醫科大學病媒生物與蟲媒病實驗室飼養至今，飼養條件為：溫度（26±1） ℃，相對濕度（60±10）%，光照12∶12 （L∶D），提供兔飼料作為食料。

1.2 供試昆蟲病原真菌

選擇2種常見昆蟲病原真菌作為對峙試驗的供試病原菌，即球孢白僵菌（Beauveria bassiana）和萊氏野村菌（Nomuraea rileyi），這2種真菌均為本實驗室自主分離的菌種。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備 取德國小蠊若蟲5個階段，成蟲1個階段，其中成蟲階段分雌蟲和雄蟲，共7種蟲態，每個階段各設置3組重復，取樣前，德國小蠊需要饑餓24 h。取樣時，第1和第2階段的若蟲置于無菌離心管內，用75%酒精浸泡10 min后，用無菌水漂洗3次，去除表面細菌，然后再進行研磨取樣；其余各階段的取樣，同上進行體表消毒后，在無菌的環境下，解剖取其腸道，置于無菌離心管內，再進行研磨取樣。美洲大蠊取樣相同。

1.3.2 可培養真菌的培養 參照黃振東等［7］傳統分離培養法分離純化德國小蠊腸道可培養真菌，取1.3.1中充分研磨的樣品加入200 μL的無菌水混勻，取50 μL混合液稀釋成3個不同濃度（10-4、10-6、10-8），各取50 μL均勻涂布在真菌培養基上，放入培養箱28 ℃下培養72 h。待真菌生長后，分離純化得到單個菌株，去除重復菌種。美洲大蠊操作相同。

1.3.3 可培養真菌的鑒定 參照唐萬達等［8］分子鑒定方法提取及鑒定真菌DNA，氯仿法提取DNA，真菌的ITS序列的PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送至青島睿博基因公司測序，最后將得到的測序序列在NCBI網站的GenBank上進行BLAST同源性比對。

1.3.4 拮抗菌種篩選 內生真菌對病原真菌的拮抗作用采用五點對峙培養法［9］進行測定。在直徑為9 cm的PDA平板正中央接入直徑為5 mm的昆蟲病原菌菌餅，同時在平板4個距供試菌菌餅2.5 cm處接入相同大小的內生真菌菌餅，以只接病原真菌、不接腸道真菌的平板作為對照，每個處理重復3次，25 ℃條件下培養。每24 h觀察1次，從對峙培養第3天起測量病原真菌菌落直徑和抑菌帶距離。抑菌帶距離（D）為內生真菌菌落與供試菌菌落之間的無菌區域寬度。抑制率（inhibitory rate，IR）公式為：

2 結果與分析

2.1 蜚蠊腸道可培養真菌分子鑒定結果

在美洲大蠊腸道中分離得到8屬12株內生真菌，德國小蠊腸道中分離得到3屬4株內生真菌（表1）。

表1 美洲大蠊和德國小蠊腸道內生真菌Blast對比結果

2.2 蜚蠊腸道內生真菌對昆蟲病原真菌的抑菌效果

2種蜚蠊腸道內生真菌對2種昆蟲病原真菌的拮抗作用分為強（抑制率≥75%）、較強（50%≤抑制率＜75%）和弱（抑制率＜50%）3個等級［10］，抑制率在75%以上視為拮抗活性顯著。本研究結果表明，2種蜚蠊腸道內存在具有較強的昆蟲病原真菌拮抗活性的真菌，有5株腸道內生真菌對球孢白僵菌具有拮抗作用，占可培養腸道內生真菌菌株總數的31.25%，且這5株腸道內生真菌對球孢白僵菌的抑制率都達到50%以上，拮抗活性較強。有9株腸道內生真菌對萊氏野村菌具有拮抗作用，占可培養腸道內生真菌菌株總數的56.25%。此外，16株內生真菌中對2種病原真菌的抑制率均達50%以上的有1株，占6.25%；只對1種病原真菌的抑制率達到50%以上的有6株，占37.50%；而對2種供試菌的抑制率皆低于10%的有6株，占37.50%，這6種真菌的拮抗活性最弱或沒有活性。由此可知，美洲大蠊和德國小蠊腸道內生真菌中廣泛存在著抑菌活性真菌，并呈現出對2種昆蟲病原真菌有不同程度的抑制作用，拮抗作用和強度存在差異（表2）。

表2 腸道內生真菌拮抗病原真菌的抑制率及抑菌帶距離

從抑菌帶寬度來看（表2），菌株D4在拮抗萊氏野村菌的平板中抑菌帶寬度為0 mm，并不完全代表病原真菌生長受到很強的抑制，與真菌本身生長速度也有關。本試驗發現，菌株D4生長速度較快，在對峙培養的第4天后，其菌落呈覆蓋式生長，具有較強的營養競爭能力，生長競爭強，能迅速占領生長空間（圖1f），與之對峙培養的萊氏野村菌生長較慢，導致其無法擴增其菌落，直接被D4真菌菌絲全部覆蓋。

在菌株M7與球孢白僵菌的對峙培養中（圖1b），兩者菌落之間不僅出現抑菌帶，而且菌株M7菌落隨著生長時間的延長，在接觸抑制處時分泌出黑紫色物質，隨著時間的增長顏色逐漸加深，并且在M7菌落靠近拮抗處有黃色滲出液滲出，且慢慢轉變為黑色顆粒。在菌株D4與球孢白僵菌的對峙培養中（圖1c），隨著菌株D4的生長，球孢白僵菌的生長受到抑制，與對照組（圖1a）相比，菌落邊緣菌絲淡化，貼近培養基且變色幾乎沒有氣生菌絲。

同樣，有些菌株的菌落雖然自身生長速度緩慢，如圖1d和圖1g中的腸道內生真菌，但抑菌能力強（抑制率=100%）。圖1d為菌株M8，使球孢白僵菌生長受抑制，并形成較寬的抑菌帶。同樣從表2可知：菌株M8對球孢白僵菌和萊氏野村菌均表現出較強的拮抗活性，抑制率分別達54.28%和100.00%。

圖1 腸道內生真菌對2種病原真菌的拮抗作用

3 討論與結論

本研究利用傳統分離培養法，從2種蜚蠊腸道內分離得到16株可培養真菌。美洲大蠊腸道內分離得到的內生真菌以假絲酵母屬為主，占美洲大蠊腸道內分離得到的可培養真菌總株數的25%，共3株，分別 為C. palmioleophila、C. viswanathii和C. duobushaemulonii；德國小蠊腸道內分離得到的內生真菌以曲霉屬為主，占德國小蠊腸道內分離得到的可培養真菌總株數的50%，共2株，分別為A. candidus和A. flavus，這與馬濤等［11-12］在野外不同生境采集到的2種蜚蠊樣本腸道內生菌的研究結果基本一致。本研究分離得到的蜚蠊腸道內生真菌的種屬和抗菌活性分布具有多樣性，但菌株數量較其他研究有所減少，可能與本研究所用的德國小蠊由于在實驗室內長期飼養致其腸道菌群因食物單一而變得更為單一有關。上述研究結果表明，蜚蠊腸道內生真菌組成與其生長環境具有相關性，野外或其他生境下取樣的美洲大蠊和德國小蠊腸道內生真菌組成較實驗室內長期飼養的蜚蠊腸道內生真菌組成更為復雜。

在2種蜚蠊腸道內分離得到的可培養真菌中，對球孢白僵菌和萊氏野村菌均有拮抗作用的有10種，占2種蜚蠊腸道內分離可培養真菌總株數的62.50%。且不同屬的腸道內生真菌對同一病原真菌表現出不同程度的拮抗性，同種屬的菌種其抑菌活性亦存在相似性或差異性。從抑菌帶寬度來看，多數對峙結果中的抑菌帶寬度為3 mm左右。真菌拮抗機制通常包括多重作用，如重寄生、競爭、分泌抑菌物質和產生抑菌揮發性氣體等［13-14］。例如菌株M7在與球孢白僵菌的對峙培養中，兩者菌落之間不僅出現抑菌帶，且在接觸抑制處時分泌出黑紫色物質。正如其他同屬菌株產生的醛類、烯類及醇類物質會抑制病原真菌生長［15］，結合試驗結果推測A. candidus隨著對峙培養時間的增長，拮抗作用隨之增強，且會在拮抗處分泌某種拮抗物質。

同樣，有些菌株的菌落雖然生長速度慢，但這類腸道內生真菌可能會釋放一些代謝產物到培養基中，或產生一些揮發性抑菌氣體，使病原真菌生長受抑制［14］。在通常情況下，真菌的分生孢子生長越多，成功萌發后才會穿透昆蟲體壁并侵入體腔內，其作為微生物殺蟲劑的致病能力就越高。在平板對峙中，受拮抗的萊氏野村菌白色菌絲少見，不利于綠色分生孢子的產生，與致病毒力相關的菌體生理代謝產物草酸鈣結晶相應地減少。說明某些腸道內生真菌的相關活性物質抑制了萊氏野村菌分生孢子的產生，降低了草酸產生的能力，從而降低了該真菌的侵襲力。草酸鈣結晶是病原真菌的生理代謝產物，且與其對寄主的侵染力有直接關系，能使寄主昆蟲血液變性，從而破壞血細胞［16］。

本研究從美洲大蠊和德國小蠊腸道內分離篩選到對病原真菌具有拮抗作用的真菌，不僅從腸道共生體真菌的角度解釋了蜚蠊不易受昆蟲病原真菌感染、免疫力增強的原因，而且為開發新型生物蜚蠊防治劑提供了借鑒。在美洲大蠊腸道內篩選出可同時抑制球孢白僵菌和萊氏野村菌生長的A. candidus和K. blattae，這2種真菌顯示出較強的拮抗活性。A. candidus和K. blattae這2種真菌拮抗球孢白僵菌和萊氏野村菌感染的機制有待進一步研究，以期為從其他方面提高球孢白僵菌和萊氏野村菌粉毒力、增強防治效果提供一定的參考意義。