基于超高效液相色譜法-串聯質譜技術和網絡藥理學的復方感冒靈成分及作用機制驗證

劉黎明 戴玉豪 楊 維 符國成 龔小兵 劉 陳 吳文潔 陳海剛 李韶菁

(1 中國中醫科學院中藥研究所，北京，100010； 2 華潤三九(郴州)制藥有限公司，郴州，423000； 3 安徽中醫藥大學，合肥，230000)

復方感冒靈顆粒是由山銀花、五指柑、野菊花、三叉苦、南板藍根、崗梅、對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏、咖啡因組成的復方制劑，具有辛涼解表、清熱解毒的功效，主治風熱感冒之發熱，微惡風寒，頭身痛，口干而渴，鼻塞涕濁，咽喉紅腫疼痛，咳嗽，痰黃黏稠等癥。本研究采用超高效液相色譜法-串聯質譜(Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS)技術對復方感冒靈顆粒醇提物中主要化學成分進行鑒定并確定其來源歸屬。

基于復方感冒靈成分譜的確定，本部分將復方感冒靈給予大鼠后，選取不同給藥后的時間點進行取樣，采用UPLC-MS/MS技術鑒定大鼠血清中復方感冒靈顆粒的主要化學成分，進行復方感冒靈入血成分譜的鑒定。

目前復方感冒靈顆粒成分、靶點、功效、疾病之間的相互聯系未見報道。因此，本研究在復方感冒靈主要藥效成分的基礎上，首次對其進行整合網絡藥理學的研究，建立成分、靶點、功效、疾病的關系網絡，為該藥作用機制闡明奠定了基礎。再利用網絡藥理學方法對復方感冒靈給予大鼠后體內高暴露的成分進行分析，針對其主要藥理作用預測作用靶點和通路，構建“成分-靶點-功效-疾病”關系網絡，探討其主要作用通路及靶點，并進行靶點驗證分析，為該藥的作用機制研究提供依據[1-3]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與細胞 RAW264.7細胞購自國家生物醫學實驗細胞資源庫(BMCR)，貨號：SCSP-5036。雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，7周齡，體質量210～230 g。由北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號：SCXK(京)2016-0006]提供，置于溫度(25±2)℃，濕度40%～70%飼養室，動物均自由飲水進食，12 h/12 h明暗交替。實驗動物的使用在中國中醫科學院中藥研究所動物中心[實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2015-0041]進行。實驗方案實施前獲得中國中醫科學院中藥研究所實驗動物管理和使用委員會的審核與批準(倫理審批號：2021B193)。

1.1.2 藥物 綠原酸(批號：DSTDL002101)、新綠原酸(批號：DSTDX001502)、隱綠原酸(批號：DSTDY003502)、異綠原酸A(批號：DSTDY003601)、異綠原酸B(批號：DSTDY003701)、異綠原酸C(批號：DSTDY003801)、齊墩果酸(批號：DSTDQ005101)、腺苷(批號：DSTDX004701)和毛冬青酸(批號：DST201201-037)購自成都德思特生物技術有限公司。蒙花苷(批號：H-123100-NU1)、斷氧化馬錢子苷(批號：H-168300-NU1)、木犀草素-7-O-葡萄糖苷(批號：H-156300-NU1)購自深圳振強生物技術有限公司。馬來酸氯苯那敏(批號：C015-190414)、咖啡因(批號：1012004405)、對乙酰氨基酚(批號：202007119A)、山銀花(批號：20201001，產地湖南)、野菊花(批號：20201001，產地安徽)、崗梅(批號：20201002，產地廣東)、三叉苦(批號：20201002，產地廣西)、五指柑(批號：20201002，產地廣西)、南板藍根(批號：20201002，產地廣西)、復方感冒靈顆粒流膏(批號：Z2012122)和復方感冒靈顆粒成品(批號：2012020)均由華潤三九(郴州)制藥有限公司提供。

1.1.3 試劑與儀器 甲醇(MeOH，HPLC純試劑，Honeywell公司，德國，貨號：AH230-4)；甲酸(ROE公司，美國，貨號：Y0001970)；胎牛血清(Hyclone公司，美國，貨號：SH3040602)；DMEM培養基(Invitrogen公司，美國，貨號：C11995)；0.25%胰蛋白酶(Invitrogen公司，美國，貨號：25200056)；青-鏈霉素雙抗溶液(Invitrogen公司，美國，貨號：15140122)；PBS緩沖液(碧云天生物技術公司，貨號：C0221A)；腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)-α酶聯免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)試劑盒(碧云天生物技術公司，貨號：PT516)；白細胞介素(Interleukin，IL)-2 ELISA試劑盒(碧云天生物技術公司，貨號：PI577)；IL-17 ELISA試劑盒(碧云天生物技術公司，貨號：PI548)。UltiMate 3000液相色譜儀(Dionex公司，美國，型號：Dionex UltiMate 3000)；Q-ExactiveTM Orbitrap質譜儀(Thermo公司，美國，型號：IQLAAEGAAPFALGMAZR)；Techne氮氣吹干裝置(Techne公司，美國，型號：NAI-DCY-24Y)；IKA Vibrax VXR小型搖床(IKA Vibrax VX公司，德國，型號：IKA Vibrax VXR)；IKA MS3 Basic渦旋混合器(IKA MS3 Basic公司，德國，型號：IKA MS3 Basic)；CO2恒溫培養箱(Genscript公司，中國，MCO-15AC)；臺式高速冷凍離心機(長沙湘儀儀器有限公司，型號：H-1850R)；酶標儀(Tecan公司，瑞士，型號：SUNRISE)；萬級天平(上海精密科學儀器有限公司，型號：FA2204B)；數顯恒溫攪拌恒溫水箱(常州國華電器有限公司，型號：HH-60)。

1.1.4 網絡藥理數據庫 繪制化合物結構：Chemdraw軟件。化合物作用靶點預測：Pubchem數據庫，Swiss Target Prediction數據庫。作用靶點信息規范：Uniprot數據庫。藥效作用相關靶點收集：在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)，GeneCards數據庫。構建蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網絡：STRING數據庫。PPI網絡可視化：Cytoscape軟件。生物學功能分析：Metascape數據庫。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制 對照品溶液：精密吸取1 mg/mL對照品溶液各30 μL，加入甲醇550 μL，渦旋混勻，配制成濃度為30 μg/mL的混合對照品溶液。精密吸取30 μL 30 μg/mL的混合對照品溶液，加甲醇870 μL，渦旋混勻，配置成濃度為1 μg/mL的混合對照品溶液。供試品溶液：1)藥材處理。精密稱取中藥粉末1 g，加入75%甲醇10 mL，浸泡1 h，超聲提取30 min，12 000×g離心10 min，過濾膜，濾液4 ℃保存。2)浸膏處理。稱量浸膏0.1 g，加入75%甲醇10 mL，超聲溶解，12 000×g離心10 min，取1 mL過濾膜，濾液4 ℃保存。3)復方感冒靈顆粒處理。復方感冒靈顆粒研磨粉碎，稱取1 g，加入75%甲醇10 mL，超聲溶解，12 000×g離心10 min，取1 mL過濾膜，濾液4 ℃保存。4)血漿樣品處理。混合同一時間點血漿樣品，加入3倍量甲醇溶液，1 500×g渦旋5 min，12 000×g離心10 min，吸取上清液，氮氣吹干，90%水甲醇復溶，1 500×g渦旋5 min，12 000×g離心10 min，吸取上清液進樣分析。

1.2.2 色譜及質譜條件 1)色譜條件。色譜柱：Acquity UPLC ? HSS C18 column(1.8 μm，2.1 mm×150 mm，ID：186003976)。柱溫：40 ℃。流動相：A，H2O(0.1% HCOOH)；B，CH3OH。洗脫條件見表1。流速：0.3 mL/min。樣品溫度：6 ℃。分析時間：42 min。2)質譜條件。電噴霧離子源正/負離子檢測模式，電離源電壓3 800 V，毛細管電壓，霧化溫度320 ℃；離子傳輸管溫度350 ℃，S-Lens射頻電壓60 V，鞘氣流速40 arb，輔助氣流速10 au，鞘氣和輔助氣均為高純氮氣(純度>99.99%)，采用高分辨全離子掃描-數據依賴-二級離子掃描模式(Full MS ddMS2)；一級全離子掃描(分辨率R=70 000，掃描質量范圍m/z 75～1 125)，二級全離子掃描(分辨率R=17 500)，碰撞電壓(NES)為20 eV、40 eV和60 eV。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

1.2.3 檢測 SD大鼠(n=6)適應喂養后，口服給予臨床劑量復方感冒靈顆粒提取物。眼靜脈叢采血。采血時間點：給藥前0 min，給藥開始后5 min、15 min、30 min以及1 h、2 h、4 h、6 h、8 h及24 h后。采集血樣于乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic Acid，EDTA)抗凝EP管中，12 000×g離心1 min，轉移上層血漿至EP管中，于-70 ℃保存。采用液質聯用技術進行全譜分析，基于復方感冒靈顆粒成分譜，結合化合物精確質量數、碎片譜和裂解規律對復方感冒靈顆粒在體內主要的暴露成分、乙酰氨基酚、咖啡因、馬來酸氯苯那敏的代謝產物進行分析。

1.2.4 單體化合物靶點的獲取 利用Chemdraw軟件繪制化合物結構，通過Pubchem數據庫比對后上傳至Swiss Target Prediction數據庫并限定物種為“Homo sapiens”，對體內暴露的17種單體化合物的作用靶點進行預測，篩選條件為probability值>0，刪除重復靶點，使用Uniprot數據庫對靶點進行規范[4]。

1.2.5 藥效作用靶點的獲取 以“Antibacterial”“Anti-inflammatory”“Antipyretic”“Antiviral”等作為關鍵詞，使用OMIM、GeneCards數據庫收集匯總與復方感冒靈抗菌、抗炎、解熱、抗病毒4種主要藥效作用的相關靶點，并運用Uniprot數據庫進行轉換[5-7]；刪除重復靶點基因，構建藥效作用靶點數據庫。

1.2.6 入血成分發揮藥效靶點預測及PPI網絡構建與拓撲屬性分析 通過韋恩圖取交集，獲得藥效與成分的共靶點。將共靶點上傳STRING數據庫，限定物種“Homo sapiens”，構建成分-藥效作用靶標的PPI網絡[8]。采用Cytoscape軟件對PPI網絡進行可視化分析，分析相關靶點的拓撲參數，篩選大于交集網絡所有節點中位值的靶點，得出排名前10位的關鍵靶點[9]。

1.2.7 基因本體富集分析和京都基因與基因組百科全書富集分析 將交集基因導入Metascape數據庫[10]，物種限定“Home Sapiens”，利用Enrichment功能，依次選擇生物過程(Biological Process，BP)、細胞組分(Cellular Component，CC)和分子功能(Molecular Function，MF)對藥效的靶點進行基因本體(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，獲得三九感冒靈“成分-靶點-通路-功效”網絡圖。按P value升序進行排序，篩選出具有顯著差異的生物過程和可靠的靶點通路，進行可視化分析，將結果以三合一條形圖與雙Y軸兩側條形圖展示。

1.2.8 靶點驗證分析 取生長狀態良好的RAW264.7細胞，以每孔5×105個的密度接種在24孔細胞培養板，于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養過夜后，磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline，PBS)清洗2遍。將細胞分為空白對照組、模型組、給藥組。空白對照組和模型組加入500 μL杜爾貝科改良伊格爾培養基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium，DMEM)，給藥組加入含高劑量、中劑量、低劑量感冒靈顆粒藥液的DMEM各500 μL預處理1 h后，模型組和給藥組均加入脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激細胞，終濃度為1 μg/mL，18 h后收集細胞培養基，4 ℃、1 000×g離心10 min后取上清液。采用ELISA法分別檢測TNF-α、IL-2、IL-17的表達水平。

2 結果

2.1 樣品檢測結果 根據化學成分的精確質量數、碎片譜和裂解規律開展復方感冒靈顆粒及其組成中藥的成分譜分析，并確定復方感冒靈顆粒的化學組成以及成分來源歸屬。見表2。本研究在復方感冒靈顆粒中共鑒定出170個化合物，包括167個中藥類成分(黃酮類38個、有機酸類15個、生物堿類8個、香豆素類10個、環烯醚萜苷類7個、萜類35個、苯并吡喃類和色烯類化合物10個、酚酸類27個、喹唑酮類5個、吲哚類2個、其他類9個)、3個化藥類成分和1個輔料成分。各成分在復方感冒靈顆粒提取液中的色譜峰面積在1×109以上的成分共7個，按峰面積從大到小的順序排列依次為咖啡因、對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏、異綠原酸C、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸B。見圖1。

圖1 單體化合物藥效靶點交集

2.2 入血成分檢測結果 對復方感冒靈顆粒入血成分進行鑒定，共得到21個體內暴露成分，包括17個中藥成分、3個化藥成分和1個輔料。見表2。

表2 復方感冒靈顆粒體內暴露成分詳細信息

2.3 復方感冒靈顆粒體內暴露成分的靶點篩選 對體內暴露的17種單體化合物的作用靶點進行預測，共檢索得到211個作用靶點。對抗菌、抗炎、解熱、抗病毒4種主要藥效的相關靶點進行檢索，得到583個潛在靶點，并與化合物的作用靶點取交集得到43個共靶點。

2.4 PPI網絡建立及核心靶點篩選 構建單體化合物與藥效作用43個交集靶點的PPI分析網絡，節點表示預測靶點，節點之間的連線代表2個靶點間具有相互作用關系。見圖2。篩選出前10個核心靶點，包括腫瘤壞死因子(TNF)、血管內皮生長因子A(Vascular Endothelial Growth Factor A，VEGFA)、表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)、胱天蛋白酶3(Caspase-3，CASP3)、前列腺素內過氧化物合酶2(Prostaglandin-endoperoxide Synthase 2，PTGS2)、促分裂原活化的蛋白激酶1(Mitogen-activated Protein Kinase-1，MAPK1)、信號轉導及轉錄激活因子3(Signal Transducer and Activator of Transcription-3，STAT3)、基質金屬蛋白酶9(Mitochondrial Membrane Potential-9，MMP9)、白細胞介素-2(IL-2)以及促分裂原活化的蛋白激酶14(Mitogen-activated Protein Kinase-14，MAPK14)。見表3。

圖2 單體化合物與藥效交集靶點PPI

表3 預測復方感冒靈顆粒發揮藥效的核心靶點

2.5 成分-靶點-通路-功效網絡的構建與分析 核心靶點對應信號通路分析，獲得三九感冒靈“成分-靶點-通路-功效”網絡圖，黃色節點(AI、AV、AP)代表藥效；紫色節點(KJ、SP、YBA、MHG、BP、BT、DY)代表復方感冒靈顆粒的入血成分；藍色節點代表入血成分的作用靶點；綠色節點代表作用靶點富集的信號通路；節點間的連線表示成分、靶點、藥效、通路的連接關系。見圖3。選擇復方感冒靈顆粒7個入血成分的21個作用靶點分析，主要與抗炎(Anti-inflammatory，AI)、抗病毒(Antiviral，AV)、解熱(Antipyretic，AP)3種藥效產生關聯，富集在55個信號通路上。

圖3 復方感冒靈顆粒“成分-靶點-藥效-通路”網絡

2.6 靶點GO功能分析及KEGG通路分析 PPI網絡重要靶點的富集分析顯示，復方感冒靈顆粒作用涉及細胞遷移調控、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路調控、炎癥反應調控等生物過程，GO分析了重要靶點在BP、CC以及MF 3個大類中的富集，根據富集程度列舉排名前7的生物學功能條目。見圖4。其中綠色代表BP，橘色代表CC，藍色代表MF；富集程度排名前7的生物學功能條目主要包括miRNA對參與基因沉默的miRNA產生的調控，RNA對參與基因沉默的小RNA產生的調控，細胞對鎘離子的反應，神經炎癥反應的調節，對尼古丁的反應，神經炎癥反應，miRNA沉默基因中miRNA的產生，按照差異顯著性進行排列。見表4。KEGG分析了重要靶點的生物信號通路富集，根據富集程度列舉排名前15的生物信號通路，結果顯示，靶點主要涉及糖尿病并發癥通路、癌癥蛋白多糖通路、癌癥通路、IL-17信號通路、丙型肝炎、TNF信號通路、AGE-RAGE信號通路、麻疹、血小板激活等信號通路，根據差異顯著性值對富集程度前15的生物信號通路進行排列。見圖5，表5。

圖4 靶點GO功能富集分析

圖5 靶點KEGG通路分析

2.7 靶點驗證分析 感冒靈顆粒對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥模型TNF-α、IL-2、IL-17釋放的影響，與空白對照組比較，模型組RAW264.7細胞TNF-α、IL-2、IL-17水平升高(均P<0.01)；與模型組比較，感冒靈顆粒各劑量組均抑制TNF-α、IL-2、IL-17水平(均P<0.01)。見圖6。

圖6 復方感冒靈顆粒對RAW264.7細胞TNF-α、IL-2、IL-17水平影響

3 討論

復方感冒靈顆粒具有辛涼解表、清熱解毒的功效，主治風熱感冒之發熱，微惡風寒，頭身痛，口干而渴，鼻塞涕濁等癥。但其物質基礎仍然不清楚，因此本研究以UPLC-MS/MS為研究方法，探討復方感冒靈顆粒的藥效物質基礎。共鑒定出復方感冒靈顆粒的170個化合物，包括中藥類成分、化藥類成分和輔料成分，成功構建了復方感冒靈顆粒成分譜，確定各成分來的中藥來源，其為復方感冒靈的深入研究提供理論依據。

采用液質聯用技術對復方感冒靈顆粒給予大鼠后，大鼠體內血清的暴露成分進行系統研究，確定了復方感冒靈的入血成分群，為后續網絡藥理學預測其發揮抗炎、抗病毒、抗菌等藥理作用的研究提供物質基礎。

基于網絡藥理學，對體內暴露的中藥成分分析，構建了復方感冒靈顆粒“成分-靶點-通路-功效”的關聯網絡。17個中藥成分作用于211個靶點，與功效的交集靶點共43個，依據PPI分析得到的前10位核心靶點為TNF、VEGFA、EGFR、CASP3、PTGS2、MAPK1、STAT3、MMP9、IL-2以及MAPK14[11-17]，主要涉及對細胞遷移調控、對跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路調控、對炎癥反應調控等生物過程。如具有雙向免疫調節作用的免疫激活劑(IL-2)；激活多條信號轉導通路，參與細胞凋亡、炎癥和免疫的TNF(腫瘤壞死因子)[18]；與非小細胞肺癌相關的EGFR(表皮生長因子受體)、MMP-9(基質金屬蛋白酶9)，MMP-9作為特異性降解細胞外基質的蛋白酶家族成員，在氣道重塑中也起非常重要的作用[19-20]；參與細胞凋亡、癌基因轉化、炎癥反應的MAPK家族等。KEGG通路富集分析顯示，復方感冒靈顆粒的成分涉及糖尿病、IL-17信號通路、麻疹、血小板激活等多種信號通路。復方感冒靈核心靶點對應的功效為解熱、抗炎與抗病毒，發揮該藥理作用的化合物可能為：三甲氧基苯甲醇-葡萄糖苷、蒙花苷、白當歸素-O-葡萄糖苷、丙基葡萄糖-脫水葡萄糖、斷氧化馬錢子苷、異綠原酸B、異綠原酸A與塊莖酸葡萄糖苷。在細胞水平上，采用LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥模型實驗。結果顯示相較于模型組，復方感冒靈顆粒各給藥組的TNF、IL-2、IL-17水平均下降且有統計學差異，提示復方感冒靈的部分核心靶點TNF、IL-2、IL-17，可能是發揮抗炎作用的信號通路。

綜上所述，復方感冒靈顆粒展現出其廣泛的臨床方面的應用潛力。本研究采用UPLC-MS/MS技術與整合網絡藥理學相結合的方法，對復方感冒靈顆粒的成分譜、體內代謝譜、作用靶點及其信號通路進行了系統研究，初步揭示了復方感冒靈解熱、抗炎與抗病毒功效的物質基礎，揭示了其作用機制可能與TNF、VEGFA、EGFR、CASP3、PTGS2、MAPK1、STAT3、MMP9、IL-2以及MAPK14信號通路相關，闡明了其多成分、多靶點的治療特點，為復方感冒靈的深入研究提供理論依據。