氯雷他定與消風止癢顆粒對3種蕁麻疹動物模型的藥效評價研究

龐 博 徐英莉 劉曉峰 陳夢蘋 王雅欣 姚榮妹 周利潤 曹 姍 崔曉蘭

(1 中國中醫科學院中藥研究所生物安全實驗室，北京，100700； 2 遼寧醫藥職業學院，沈陽，110101； 3 天津中醫藥大學中醫藥學院，天津，301617)

慢性蕁麻疹(Chronic Urticaria,CU)是由于皮膚黏膜小血管暫時擴張和通透性增加而引發的一種局限性血管反應，臨床表現為風團，常伴有劇烈瘙癢。發病原因有外源性、內源性及特發性3種因素,外源性因素主要有食物、藥物、感染、吸入物及物理刺激；內源性主要有精神因素、全身性疾病及免疫異常；特發性多被認為是多因素誘發。現代對慢性蕁麻疹的研究認為是體內可能存在組胺釋放因子或肥大細胞呈高反應性現象，在多因素刺激下使肥大細胞活化、脫顆粒、釋放組胺等介質，導致蕁麻疹[1]。蕁麻疹發病中主要效應細胞為肥大細胞，其發病的中心環節為肥大細胞活化以及活化后發生的事件。引起肥大細胞活化的機制有免疫機制及非免疫機制，免疫機制中Ⅰ型變態反應作用機制最為明確，在急性蕁麻疹發病中起重要作用，但與慢性蕁麻疹發生的關系不大。體內的抗IgE分子及抗IgE受體的自身抗體可以通過Ⅱ型變態反應活化肥大細胞，這一機制在慢性自發性蕁麻疹發生中占重要地位。非免疫機制在蕁麻疹尤其是慢性蕁麻疹發生中起重要作用，物理因素、微生物感染可不經過免疫途徑激活肥大細胞。

本研究選用臨床常用治療蕁麻疹的西藥代表藥氯雷他定和中藥代表藥消風止癢顆粒為研究對象，對3種蕁麻疹動物模型進行給藥治療，探究2種臨床常用藥對不同因素引發的慢性蕁麻疹在藥效學是否存在不同，為氯雷他定和消風止癢顆粒臨床合理用藥提供藥效學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)級6周齡BALB/c小鼠，體質量(20±2)g，雌雄各半；SPF級7周齡SD大鼠，體質量(200±20)g，雌雄各半，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2016-0011。普通級7周齡豚鼠，體質量(260±10)g，雌雄各半，由北京金牧陽實驗動物養殖有限責任公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2020-0002。所有動物均飼養在(23±1)℃，濕度(50±2)%的實驗室環境，自由飲食飲水。實驗中所有操作均遵循美國國立衛生研究院(National Institutes of Health，NIH)及北京市實驗動物倫理委員會的規定，并經過中國中醫科學院中藥研究所動物倫理委員會批準(倫理審批號：小鼠為2021D021；大鼠為2021D025；豚鼠為2021D026)。

1.1.2 藥物 氯雷他定片(拜爾醫藥保健有限公司啟東分公司，生產批號：JS13160)；消風止癢顆粒(陜西華西制藥股份有限公司，生產批號：210731)。

1.1.3 試劑與儀器 二硝基苯基(Dinitrophenyl，DNP)-IgE單克隆抗體(SIGMA公司，美國，批號：22181012)；2,4-二硝基氟苯(2，4-Dinitrofluorobenzene，DNFB)(SIGMA公司，美國，批號：BCCD3869)；伊文思藍(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20200730)；卵白蛋白(SIGMA公司，美國，批號：SLCH2414)；氫氧化鋁(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20201119)；甲苯胺藍染色液(北京索萊寶科技有限公司，批號：20210427)；臺氏液(北京索萊寶科技有限公司，批號：20210426)；二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)(北京拜爾迪生物科技有限公司，批號：12029032)；無水乙醇(天津大茂化學試劑廠，批號：20210415)；小鼠血清IgE試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，批號：L210304289)；小鼠血清組胺試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司，批號：05/2021)；小鼠血清5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司，批號：05/2021)；大鼠血清IgE試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，批號：L210513363)；大鼠血清P物質試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，批號：L210513361)。電子分析天平(OhausCorp.Brock.WJ.，美國，型號：AR1140)，電子天平(上海越平科學儀器有限公司，型號：YP1002)，電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，型號：AL204]，低溫高速離心機(Eppendorf，德國，型號：5810R)，多功能酶標儀(PerkinElmer公司，美國，型號：En-spire)，倒置顯微鏡(OPYMPUS公司，日本，型號：CKX41)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

1.2.1.1 小鼠免疫性接觸性慢性蕁麻疹模型 BALB/c小鼠40只，按體質量隨機分為正常對照組、模型對照組、氯雷他定組、消風止癢顆粒組，每組10只，雌雄各半。每組小鼠預先背部去毛2 cm×2 cm，除正常對照組外，其余各組小鼠尾靜脈注射1∶5 000抗DNP-IgE單克隆抗體進行致敏造模，0.5 mL/只。24 h后，各致敏造模組小鼠雙耳背面涂0.15% DNFB 50 μL進行激發，正常對照組在同等條件下注射及涂抹生理鹽水[2-3]。

1.2.1.2 大鼠免疫性非接觸性慢性蕁麻疹模型 40只SD大鼠，按體質量隨機分為正常對照組、模型對照組、氯雷他定對照組、消風止癢顆粒組，每組10只，雌雄各半。致敏造模：實驗第1天除正常對照組外，其余各組大鼠腹腔注射1 mg卵白蛋白致敏，注射體積為1 mL，氫氧化鋁作為佐劑(卵白蛋白：氫氧化鋁為1∶1)，并在第5、10天各重復致敏1次，共致敏3次，正常對照組在同等條件下腹腔注射生理鹽水[4-5]。

1.2.1.3 豚鼠非免疫性接觸性蕁麻疹模型 豚鼠30只，按體質量隨機分為模型對照組、氯雷他定組、消風止癢顆粒組，每組8只，雌雄各半。末次給藥30 min后，用80%DMSO無水乙醇溶液均勻涂抹豚鼠右耳郭兩面，100 μL/只，左耳在同等條件下涂抹生理鹽水[6-7]。

1.2.2 給藥方法

1.2.2.1 劑量設定 對照藥氯雷他定片對小鼠、大鼠、豚鼠的臨床等效劑量換算分別為1.84 mg/kg、0.93 mg/kg、0.72 mg/kg；消風止癢顆粒對小鼠、大鼠、豚鼠的臨床等效劑量換算分別為16.50 g/kg、8.40 g/kg、6.45 g/kg。

1.2.2.2 小鼠免疫性接觸性慢性蕁麻疹模型給藥方法 氯雷他定組和消風止癢顆粒組小鼠在致敏當天開始按照0.2 mL/10 g的劑量灌胃給藥，正常對照組和模型對照組同等條件下給蒸餾水，1次/d，連續7 d。

1.2.2.3 大鼠免疫性非接觸性慢性蕁麻疹模型給藥方法 氯雷他定組和消風止癢顆粒組大鼠從初次致敏后第6天開始按1 mL/100 g灌胃給予相應藥物，連續給藥9 d，正常對照組和模型對照組在同等條件下給予蒸餾水。

1.2.2.4 豚鼠非免疫性接觸性蕁麻疹模型給藥方法 氯雷他定組和消風止癢顆粒組豚鼠按照1 mL/100 g灌胃給藥，1次/d，連續7 d，模型對照組在同等條件下灌胃蒸餾水。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 小鼠免疫性接觸性慢性蕁麻疹模型檢測指標與方法 1)各組小鼠分別于激發后1 h、6 h、24 h觀察搔抓次數，每次連續記錄10 min內搔抓次數。2)激發后24 h尾靜脈注射0.5%伊文思藍，觀察注射后第1 h、6 h、24 h、48 h及72 h內背部暴露皮膚處風團出現的數量、消退時間，每次連續記錄1 h。3)激發24 h后測雙耳厚度(每側3個點)；第7天雙耳打孔各取3個耳片，稱重。4)第7天各組小鼠摘眼球采血0.5 mL，靜置2 h后，4 ℃下1 200×g離心10 min，吸取上清液，-80 ℃保存，分析待測。嚴格按照試劑盒說明書操作，采用酶聯免疫吸附試驗法測定血清中IgE、組胺、5-HT含量。5)采血后的小鼠脫頸椎處死，剪開腹部皮膚，沿腹白線剪開腹壁約0.5 cm，向腹腔內注入臺氏液，輕揉腹部3 min，剖開腹腔，吸出全部液體，置于離心管中[3]。低溫超速離心機在4 ℃，1 000×g的條件下離心10 min，棄上清得肥大細胞沉淀物，加入臺氏液混懸，滴加甲苯胺藍染色液，混勻，染色30 min。吸取1滴染色后肥大細胞懸液于載玻片上，蓋上蓋玻片，待液體晾干后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。先用10×物鏡找到清晰視野下的細胞，再用20×物鏡下進行肥大細胞觀察與計數，按“弓”字形順序依次計數100個肥大細胞，并計數其中脫顆粒的肥大細胞，計算脫顆粒百分率和抑制率[8]。肥大細胞脫顆粒率(%)=脫顆粒細胞數/肥大細胞總數×100%；肥大細胞脫顆粒抑制率(%)=(1-給藥組的脫顆粒率/模型組的脫顆粒率)×100%。

1.2.3.2 大鼠免疫性非接觸性慢性蕁麻疹模型檢測指標與方法 1)末次給藥24 h后，各組大鼠經眼內眥采集血液2 mL于干凈的EP管(微量離心管)中，4 ℃過夜，在4 ℃條件下1 200×g離心10 min，吸取上清液，-80 ℃保存，分析待測。嚴格按照試劑盒說明書操作，采用酶聯免疫吸附試驗法測定血清中IgE、P物質的水平。2)大鼠經異弗烷麻醉后，剪開腹部皮膚，沿腹白線剪開腹壁約1 cm，向腹腔內注入臺氏液，輕揉腹部3 min，剖開腹腔，吸出全部液體，置于離心管中。低溫超速離心機在4 ℃，1 000×g的條件下離心10 min，棄上清得肥大細胞沉淀物，加入臺氏液混懸，甲苯胺藍染色，混勻，染色30 min。吸取1滴染色肥大細胞懸液于載玻片上，蓋上蓋玻片，待液體晾干后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。先用10×物鏡找到清晰視野下的細胞，再用20×物鏡下進行肥大細胞觀察與計數，按“弓”字順序依次計數100個肥大細胞，并計數其中脫顆粒的肥大細胞，計算脫顆粒百分率和抑制率[9]。肥大細胞脫顆粒率(%)=脫顆粒細胞數/肥大細胞總數×100%；肥大細胞脫顆粒抑制率(%)=(1-給藥組的脫顆粒率/模型組的脫顆粒率)×100%。3)摘取大鼠脾臟和胸腺，使用電子天平精密稱定，按照公式計算各組大鼠脾指數和胸腺指數[10]。脾指數=脾臟重量(mg)/大鼠體質量(g)，胸腺指數=胸腺重量(mg)/大鼠體質量(g)。

1.2.3.3 豚鼠非免疫性接觸性蕁麻疹模型檢測指標與方法 分別于涂抹DMSO后30 min、45 min、60 min、120 min、180 min用游標卡尺測量豚鼠左右耳郭外緣5 mm處3個固定點的厚度，測量結束后將3個點打耳片稱重，求平均值，計算耳腫脹度。耳腫脹度(%)=(右耳重量均值-左耳重量均值)/左耳重量均值×100%。

2 結果

2.1 對小鼠免疫性接觸性慢性蕁麻疹模型的作用 小鼠在激發后出現前爪抓撓頭面部，后爪抓撓耳朵，舔舐后肢與腹部等現象；模型對照組小鼠抓撓次數顯著增加，與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)；氯雷他定和消風止癢顆粒均可不同程度減少小鼠抓撓次數，24 h后氯雷他定組，消風止癢顆粒組與模型對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1。各組小鼠在尾靜脈注射伊文思藍1 h后均出現藍染風團，24 h后明顯減少，48 h后基本消退，72 h背部藍斑完全消退。模型對照組在1 h、6 h風團數明顯增多，與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)；氯雷他定組和消風止癢顆粒組在1 h、6 h風團數明顯減少，與模型對照組比較差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)；且消風止癢顆粒組小鼠背部藍斑數量少于氯雷他定組。見表1。模型對照組小鼠雙耳腫脹度與耳片重量顯著升高，與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)；氯雷他定和消風止癢顆粒均能緩解小鼠耳腫脹，降低耳片重量，消風止癢顆組優于氯雷他定組，與模型對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

圖1 不同時間各組小鼠抓撓行為的數量(n=10)

表1 不同時間小鼠背部藍斑的數量變化

表2 對小鼠免疫性接觸性慢性蕁麻疹模型耳厚度及重量的影響

模型對照組小鼠血清中IgE、組胺及5-HT水平均明顯升高，與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)；氯雷他定可明顯降低血清IgE、組胺和5-HT的水平，與模型對照組比較差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)；消風止癢顆粒組僅降低了血清中5-HT的水平，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組小鼠血清IgE、組胺及5-HT水平比較(n=10)

小鼠腹腔肥大細胞正常形態為圓形、邊緣光滑，甲苯胺藍將肥大細胞胞質中的顆粒被染成紫紅色，細胞核為淺藍色；脫顆粒肥大細胞腫脹變形、邊緣不整齊或顆粒自細胞膜內向外流出、顆粒顏色加深和出現空泡，則判斷為脫顆粒陽性。

正常對照組小鼠腹腔肥大細胞脫顆粒現象不明顯，脫顆粒細胞的百分率為12.70%；模型對照組小鼠腹腔肥大細胞脫顆粒現象明顯，脫顆粒細胞百分率顯著增加，為30.10%，與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)；氯雷他定和消風止癢顆粒均對小鼠腹腔肥大細胞脫顆粒現象有明顯的抑制作用，脫顆粒細胞百分率顯著降低，氯雷他定對肥大細胞的脫顆粒抑制率優于消風止癢顆粒，與模型對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 氯雷他定與消風止癢顆粒對小鼠腹腔肥大細胞脫顆粒的影響

2.2 對大鼠免疫性非接觸性慢性蕁麻疹模型的作用 模型對照組大鼠血清IgE、P物質水平升高，與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)；氯雷他定可不同程度降低大鼠血清中IgE，P物質的水平，與模型對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)；消風止癢顆粒對大鼠血清中IgE，P物質的水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠血清IgE和P物質水平的測定(n=10)

大鼠腹腔肥大細胞正常形態為圓形、邊緣光滑，甲苯胺藍將肥大細胞胞質中的顆粒被染成紫紅色，細胞核為淺藍色；脫顆粒肥大細胞腫脹變形、邊緣不整齊，顆粒顏色加深且向膜外流出，則判斷為脫顆粒陽性。正常對照組大鼠腹腔肥大細胞脫顆粒現象不明顯，脫顆粒細胞的百分率為12.30%；模型對照組大鼠腹腔肥大細胞脫顆粒現象明顯，且脫顆粒細胞的百分率顯著增加為34.10%，與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)；氯雷他定組和消風止癢顆粒組大鼠腹腔肥大細胞脫顆粒現象均有明顯減輕，脫顆粒細胞的百分率顯著降低分別為23.20%、24.10%，肥大細胞脫顆粒抑制率分別為31.96%、29.33%與模型對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。見表4。

表4 氯雷他定與消風止癢顆粒對大鼠腹腔 肥大細胞的影響

本實驗中，與正常對照組大鼠比較，模型對照組大鼠胸腺指數和脾指數均有所增加，但差異無統計學意義(P>0.05)；與模型對照組比較，氯雷他定組和消風止癢顆粒組大鼠胸腺指數和脾指數均有趨于正常水平的趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠胸腺指數和脾指數測定結果(n=10)

2.3 對豚鼠非免疫性接觸性蕁麻疹模型的作用 模型對照組豚鼠右耳在涂抹DMSO后各時間點耳腫脹明顯，與其左耳比較差異有統計學意義(P<0.01)；氯雷他定在造模后30 min、45 min右耳的腫脹明顯減輕，與模型對照組豚鼠右耳比較差異有統計學意義(P<0.05)。但60 min后，氯雷他定組豚鼠右耳與模型對照組豚鼠右耳相比之間無差異，凸顯了氯雷他定可以快速發揮的藥物特點；消風止癢顆粒在造模后45 min、60 min、120 min、180 min均可明顯減輕右耳腫脹，與模型對照組豚鼠右耳比較差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，凸顯出中藥藥效起效慢但藥效維持作用時間久的藥物特點。見表5。

表5 氯雷他定與消風止癢顆粒對豚鼠左右耳厚度的影響

模型對照組、氯雷他定組和消風止癢顆粒組豚鼠左耳涂抹生理鹽水后，重量無差異；涂抹DMSO 180 min后，模型對照組豚鼠右耳重量顯著增加，與模型對照組左耳比較差異有統計學意義(P<0.05)；氯雷他定組豚鼠右耳重量與模型對照組右耳比較有降低趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；消風止癢顆粒組豚鼠右耳重量與模型對照組右耳比較差異有統計學意義(P<0.05)；且消風止癢顆粒組豚鼠的耳腫脹度低于氯雷他定組。見表6。

表6 氯雷他定與消風止癢顆粒對豚鼠左、右耳重量的影響

3 討論

蕁麻疹屬中醫學“癮疹”范疇，古籍中即提出風邪與蕁麻疹發病密切相關。《諸病源候論·風瘙身體癮疹候》云：“人皮膚虛，為風邪所折，則起癮軫。”《千金要方·論雜風狀》云：“風邪客于肌膚，虛癢成風疹瘙瘡。”患者衛氣不固復又外感風邪，正氣無力鼓邪外出，致急性期風邪留于肌表，短期則閉郁肺氣，致肺氣失宣，總屬氣分；長期則由肌表入經絡，致營衛不和、氣滯血瘀，歸于血分。因風性開泄，易襲陽位，故蕁麻疹常發于頭面部、背部等部位，且風邪“善行而數變”，故蕁麻疹常突發突止，發無定處，反復發作，此起彼伏，伴瘙癢難耐[11]。

目前臨床治療慢性蕁麻疹多以抗組胺藥為主，第1代抗組胺藥對中樞神經有明顯的抑制作用，而止癢效果維持時間短，易引起不良反應，目前已不再使用。第2代抗組胺藥鎮靜作用弱，無抗膽堿與心臟毒性，且不良反應小，已成為治療慢性蕁麻疹的一線用藥[12]，如西替利嗪、氯雷他定、阿伐斯汀等。本研究所用氯雷他定片為長效三環類抗組胺藥，是一種選擇性外周H1受體拮抗劑。通過抑制組胺、多種白細胞介素、腫瘤壞死因子-α等炎癥介質的釋放，從而減緩過敏反應引起的各種癥狀，短期內有一定療效[13-14]。

消風止癢顆粒由防風、蟬蛻、地骨皮、蒼術(炒)、亞麻子、當歸、地黃、木通、荊芥、石膏、甘草共11味中藥相互協同共達消風清熱，除濕止癢之功，主治丘疹樣蕁麻疹，也用于濕疹、皮膚瘙癢癥。方中防風、荊芥二者均味辛性微溫，溫而不燥，長于發表散風，都可用于風疹瘙癢；地黃、地骨皮清熱涼血、除蒸，當歸、亞麻子補血活血、養血祛風、潤燥通便；蒼術燥濕健脾，祛風散寒；蟬蛻疏散風熱，透疹止癢；木通善清心火，利尿通淋，石膏善清肺熱，除煩止渴；甘草清熱解毒，調和諸藥。據現代藥理分析，方中多味藥物具有免疫調節作用，對變態反應有良好的治療作用[15-16]。

血清IgE作為介導Ⅰ型變態反應的主要抗體，在變態反應性疾病中起關鍵作用。當變應原首次侵入機體，誘導特異性B細胞產生IgE，抗體中的Fc段會與嗜酸性粒細胞或肥大細胞表面的FcεRI的α亞基結合，使機體處于致敏狀態[17]。當相同抗原再次入侵機體時，便與已經結合在致敏靶細胞上的IgE特異性結合，導致細胞脫顆粒和血管活性介質釋放，引起毛細血管擴張、通透性增強，血管內組織液進入真皮形成真皮水腫，進而形成風團[18-19]。此外，已有研究證實P物質可引發皮膚瘙癢和風團反應，誘導肥大細胞和嗜堿性粒細胞脫顆粒，以及增強肥大細胞對各種刺激的反應性，提示P物質參與了慢性蕁麻疹的發病。肥大細胞自身就能分泌P物質，P物質又反過來作用于肥大細胞和血管，從而促使P物質不斷釋放，形成病癥的持續狀態[20]。

本實驗發現，在免疫性接觸性/非接觸性慢性蕁麻疹模型實驗中，實驗動物在造模后明顯出現腹腔肥大細胞脫顆粒，皮膚出現風團，抓撓、舔舐、耳腫脹等現象。氯雷他定和消風止癢顆粒均可明顯抑制致敏動物模型肥大細胞活化，脫顆粒現象。氯雷他定能有效地減少組胺、IgE、P物質、5-HT等炎癥介質的釋放，進而緩解由慢性蕁麻疹造成皮損血管擴張引起的皮膚瘙癢、風團、水腫性斑塊等癥狀。在非免疫性接觸性蕁麻疹模型試驗中，消風止癢顆粒無論在耳腫脹度還是耳厚度的測量結果均優于氯雷他定，藥效明顯且緩解變態反應腫脹癥狀的作用持久。由此推斷，氯雷他定對免疫性慢性蕁麻疹有良好的治療效果，可迅速發揮藥效，快速抑制炎癥介質的釋放，緩解瘙癢癥狀。消風止癢顆粒則對接觸性蕁麻疹有明顯的治療作用，該方可解表、祛風止癢兼能清熱、透疹、利水，達到緩解皮膚紅腫，抑制風團之效。本實驗為氯雷他定和消風止癢顆粒的臨床合理用藥提供藥效學依據。