高乳糖飲食疊加水平臺法脾虛證模型研究與評價

盧夢雄 黃金科 王一帆 薛 紅 王鳳云 唐旭東,

(1 北京大學中醫藥臨床醫學院(西苑)，北京，100091； 2 中國中醫科學院西苑醫院，北京，100091)

脾是中醫臟象理論的重要組成部分，脾的生理功能主要體現在主運化谷食水飲，主統血，在體合肉，主四肢[1]。為驗證模型成功與否，現代研究者依據脾的功能和特性，用相應的生物化學等指標類比。脾主運化的功能以尿D-木糖排泄率或血清D-木糖吸收率作為輔助實驗室參考指標[2]，脾主統血則類比到凝血功能的異常，如血小板數量下降[3]，在體合肉，主四肢則被闡釋為骨骼肌生理功能的異常，表現在抓力、腺苷三磷酸(Adenosine Triphosphate，ATP)水平、糖原水平下降等方面[4-6]，也有報道胃蛋白酶原和胃促生長素水平的降低[7-8]。但目前對特定模型的評價指標多較單一，不全面，且對造模過程中指標動態變化掌握頗少。

目前脾虛證造模方法多類比脾虛證的致病因素。脾虛證的致病因素有：飲食失節，損傷脾胃；過于勞神，損傷脾氣；素稟不足或年老體衰；過服苦寒瀉下藥物，損傷脾陽；他臟病變影響脾運等。相應的造模方法則有苦寒瀉下法、耗氣破氣法、飲食失節法、飲食偏嗜法、勞倦過度法等。有些造模方法采用單一因素或患者不常接觸因素，如大黃、番瀉葉等，不能真實反映現代人群脾虛證的成因。

東亞人群成年后乳糖酶活性缺乏，乳糖不能被消化、吸收，出現腹痛、腹脹、腹瀉、腸鳴等癥狀，稱為乳糖不耐受[9-11]，此癥狀與脾虛證類似，而隨著近些年乳制品消費增加，乳糖不耐受在我國發病逐漸增加[11-13]，用高乳糖飲食造模切合實際。現今人群普遍工作時間長，飲食不規律，在饑餓與過飽間頻繁轉換，因此勞倦過度和飲食失節是脾虛證重要的致病因素。本模型基于課題組前期工作[14-15]，用高乳糖飼料飼喂既是飲食偏嗜，又是瀉下之法，用水平臺站立法模擬勞倦過度，用不定時投喂來模擬飲食失節，是所謂復合因素法，能夠更好模擬現代脾虛證人群真實情況。為避免普通飼料中不可控因素對實驗結果的影響，使用美國營養學會(American Institute of Nutrition，AIN)制定的AIN-93G純化飼料作為基本飼料[16]，以滿足大鼠生長發育所需營養，并在保證各大營養素總量不變的基礎上設計高乳糖飼料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)級雄性SD大鼠42只，7周齡，體質量(260±20)g，購于斯貝福(北京)生物技術有限公司。動物許可證號：SCXK(京)2019-0010。實驗動物使用許可證：SYXK(京)2018-0018。常規飼料適應性喂養1周，每日日光燈照射(08：00-20：00)，室內溫度(22±2)℃。本研究涉及動物實驗經中國中醫科學院西苑醫院動物倫理委員會批準(倫理審批號：2019XLC004)。

1.1.2 試劑與儀器 40%高乳糖飼料和標準AIN-93G標準飼料，購自北京科澳協力飼料有限公司。配方見表1。D-木糖(北京酷來搏科技有限公司，貨號：CX12001-100G)，D-木糖試劑盒(Cohesionbio公司，英國，貨號：CAK1238)，大鼠胃蛋白酶原酶聯免疫吸附試驗試劑盒(艾恩斯生物科技有公司，貨號：34607)，大鼠饑餓素酶聯免疫吸附試驗試劑盒(艾恩斯生物科技有公司，貨號：30838)，三酰甘油(Triacylglycerol，TG)生化試劑盒(艾恩斯生物科技有公司，貨號：30371S)，腺苷三磷酸生化試劑盒(艾恩斯生物科技有公司，貨號：30726S)，肌糖原生化試劑盒(艾恩斯生物科技有公司，貨號：34667S)。水環境小平臺站立箱(112 cm×62 cm×41 cm)箱體，設置15個小平臺，平臺直徑8 cm，高10 cm，平臺周邊注水，水深2 cm，水溫保持(20±2)℃(自制)。高速冷凍離心機(Siemens公司，德國，型號：Z326K)，酶標儀(Biotek公司，美國，型號：Synergy LX)，大小鼠抓力測定儀(上海移數信息科技有限公司，型號：YLS-13A)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 采用隨機數字表法將42只SD大鼠分為7組，其中正常組12只，模型大鼠分為造模2周組、造模3周組、造模4周組，每組6只，造模2周停造1周組、造模3周停造1周組、造模4周停造1周組，每組4只。正常組給予標準配方飲食。模型SD大鼠給予40%高乳糖飼料，并且每日17：00至次日8：00放入水平臺中，不定時給予食物。分別于2周、3周、4周處死6只造模2周組、造模3周組、造模4周組大鼠和4只正常組大鼠，造模2周停造1周組、造模3周停造1周組、造模4周停造1周組停止造模1周，觀察后處死。

1.2.2 檢測指標與方法

1.2.2.1 體質量測定 每天觀察動物毛發神態活力，每周稱量動物體質量。

1.2.2.2 糞便含水量測定 每周1次收集大鼠濕便稱重，放入37 ℃烘箱中烘烤24 h，干便稱重，含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.2.3 抓力測定 每組大鼠每周進行1次抓力測定，連續測3次，取平均值。

1.2.2.4 血清D-木糖含量測定 取材時按1 mL/100 g劑量給大鼠灌胃3% D-木糖溶液，2 h后麻醉，腹主動脈取血，3 000 r/min，離心半徑18 cm，離心15 min取血清，用分光光度法測定。

1.2.2.5 血清胃蛋白酶原酶、胃促生長素、三酰甘油測定 分別用酶聯免疫吸附試驗法和分光光度法測定。

1.2.2.6 肌肉ATP、糖原測定 取大鼠左后腿腓腸肌液氮冷凍備用，分光光度法測定ATP、糖原含量。

1.2.2.7 小腸病理學 取大鼠幽門下15 cm腸段，用0.9%氯化鈉溶液洗凈放入多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片，蘇木精-伊紅(HE)染色。觀察小腸絨毛和腺體病理形態。

1.2.2.8 脾虛證判定 依據中華中醫藥學會脾胃病分會發布的《脾虛證中醫診療專家共識意見(2017)》中脾虛證診斷標準[17]，高乳糖飼喂復合因素法大鼠模型脾虛證判定：溏稀便或水樣便，腸道脹氣，體質量增加緩慢或減輕，納呆、少動、皮毛干枯少光、抓力下降等。

2 結果

2.1 一般體征 正常組大鼠皮毛光亮，肛門干凈，精神良好，活動度正常，糞便顆粒分明，體質量增長正常。大鼠給予高乳糖飼料1～2 d后出現明顯黃色水樣稀便，并且隨著造模時間的延長，皮毛逐漸變黃凌亂，失去光澤，肛周出現污穢，倦臥瞇眼，活動度差，體質量增長緩慢甚至下降。但從第3周開始出現水樣便癥狀的緩解，個別出現成形便，體質量也出現增長趨勢。

2.2 各組體質量比較 從造模開始，造模2周組、造模3周組、造模4周組和正常組的平均體質量差距逐漸變大，造模3周組差距達到最大，體質量增長最緩慢。見圖1。

圖1 各組大鼠體質量比較

2.3 各組抓力比較 從造模開始，造模2周組、造模3周組、造模4周組和正常組抓力差距漸大，造模3周組達到最大。見圖2。

圖2 各組大鼠抓力比較

2.4 各組糞便含水量比較 從造模開始，造模2周組、造模3周組、造模4周組和正常組的糞便含水量差距逐漸變大，造模2周組差距達到最大，而后回落，到造模4周組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 各組糞便含水量比較

2.5 各組血清D-木糖水平比較 血清D-木糖水平，造模2周組較正常組明顯降低(P<0.001)，造模2周停造1周組則差異無統計學意義(P>0.05)；造模3周組和造模3周停造1周組較正常組升高(P<0.01，P<0.05)，造模4周組和造模4周停造1周組較正常組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 各組血清D-木糖水平比較

2.6 各組血清胃蛋白酶原水平比較 各組較正常組血清胃蛋白酶原水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 各組血清胃蛋白酶原水平比較

2.7 各組血清胃促生長素水平比較 造模3周停造1周組血清胃促生長素水平較正常組降低(P<0.05)，造模3周組和造模3周停造1周組、造模4周停造1周組較造模2周組顯著降低(P<0.05)。見圖6。

圖6 各組血清胃促生長素水平比較

2.8 各組血清三酰甘油水平比較 造模2周停造1周組和造模3周組血清三酰甘油水平較正常組和造模2周組增加(P<0.05)，其余組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖7。

圖7 各組血清三酰甘油水平比較

2.9 各組肌肉ATP水平比較 各組與正常組之間肌肉ATP水平差異無統計學意義(P>0.05)。但造模2周停造1周組、造模3周停造1周組較造模2周組顯著降低(P<0.05)。見圖8。

圖8 各組肌肉ATP水平比較

2.10 各組肌肉糖原水平比較 造模2周停造1周組糖原含量較正常組和造模2周組減少(P<0.05)。見圖9。

圖9 各組肌肉糖原水平比較

2.11 各組血小板計數比較 造模3周組血小板計數較正常組明顯減少(P<0.001)，其余組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖10。

圖10 各組血小板計數比較

2.12 各組紅細胞計數比較 造模2周組、造模3周組、造模4周組紅細胞計數較正常組明顯增加，各停造1周組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖11。

圖11 各組紅細胞計數比較

2.13 各組小腸病理 正常組小腸絨毛排列整齊，結構完整，密度適中，底部腺體發達。與正常組比較，造模2周組小腸絨毛凌亂，結構破損，但依稀能看出絨毛形態。造模3周組小腸絨毛結構完全破壞，堆疊。造模4周組小腸絨毛形態較清晰，但密度稀松。見圖12。

圖12 各組小腸病理比較(HE染色，×100)

3 討論

脾虛證模型從1979年北京師范大學生物系消化生理科研組用大黃水煎劑灌胃昆明種小白鼠以來[18]，產生出眾多的造模方法，最終都落腳在動物表現出脾主運化、脾主升舉、脾主統血等功能的降低，對應現代醫學中的消化吸收功能不足、能量代謝低下、機體狀態衰退等臨床綜合征[19]。學界較為公認的評價指標是D-木糖水平測試，但此指標并不能完全覆蓋所有模型，因此有必要對動物模型進行系統評價。課題組已建立高乳糖疊加水平臺法所致脾虛證模型[20]，本研究則在此基礎上增加饑飽失常造模因素，使之更符合真實世界的情況，并且已有模型評價指標局限于血清D-木糖水平，只能代表脾主運化的功能，本研究則對脾的主要功能的代表性指標都進行了檢測，廣泛評價本模型的適用性。脾虛是個動態的過程，不同功能明顯減弱的時間節點不同，本研究也進行了時間上的探索。

從一般體征來看，造模3周組脾虛證最明顯，造模4周組精神和活動度等逐漸好轉。從體質量來說，造模3周組較正常組下降最多，造模4周組與正常組差異逐漸縮小。在抓力和糞便含水量方面，也是造模3周組最為明顯，造模4周組則有回升之勢。

根據分子生物學和病理學來看，則出現結論的分化。從血清D-木糖水平來看，造模2周組降低最為明顯，提示吸收功能的下降，造模3周組反而升高。從血清TG水平來看，造模3周組增加最為明顯，提示脾虛運化脂質的能力不足，導致其在血液中累積[21]。在血小板計數上，造模3周組明顯降低，提示3周為脾主統血功能下降的最優時間節點。在紅細胞計數上，各造模組均較正常組高，可能是由于腹瀉一直處于體液失衡狀態，也可能是因為能量供應不足而代償性升高以增加供氧。小腸病理顯示，造模2周組到造模3周組結構破壞逐漸嚴重，而造模4周組有所恢復，提示大鼠對單一濃度乳糖的耐受過程。其余指標差異不明顯可能是由于本研究樣本量較小，也可能與相關文獻中造模方法與本研究不同有關。停止造模后1周，大鼠各類指標反彈，為后續用藥干預研究提供了參考，即造模與給藥必須同時進行。

本模型在不同指標上的表現不一致。在脾虛證的一般體征表現和“脾主統血”方面，造模3周組最為明顯，而在代表“脾主運化”的D-木糖吸收率上則是造模2周組最為明顯。這提示脾虛證的動態過程，即脾的不同功能的降低有先后，本模型的致病因素從影響“脾主運化”功能進而影響到其他功能。

綜上所述，本研究用單一高濃度乳糖飲食疊加水平臺站立與飲食失節法干預成功建立大鼠脾虛證模型，在2周時“脾主運化”功能降低明顯，在3周時有最明顯脾虛證體征和“脾主統血”功能降低，生化和病理的部分證據也支持此結論。