碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的耐藥性及毒力特征的分子生物學研究

師志云， 馬 苗， 尹曉麗， 王良方， 侯曉慧， 張玉英， 李 剛， 王 文， 陶 佳，李莎莎， 賈 偉

肺炎克雷伯菌是一種重要的革蘭陰性機會致病菌，可引起多種感染性疾病，包括尿路感染、菌血癥、肺炎和肝膿腫等[1-2]。隨著耐多藥（MDR）和高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）菌株的出現，這些臨床菌株在地理上的快速傳播令人擔憂，對公眾健康構成了緊急威脅[3-5]。最近，碳青霉烯類耐藥高毒力肺炎克雷伯菌（CR-hvKP）感染的報道越來越多，在臨床環境中很容易傳播，導致致命的暴發，抑或成為一種新的“超級細菌”[6-7]。本研究收集臨床分離的CRKP菌株并從中篩選hvKP菌株，應用PCR等分子生物學技術檢測導致CRKP的耐藥基因及菌株的莢膜血清型、毒力基因，采用多位點序列分型（MLST）和脈沖場凝膠電泳（PFGE）等技術分析其分子流行病學特點，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集寧夏醫科大學總醫院2015年1月—2019年12月分離鑒定的臨床標本CRKP菌株103株（剔除同一患者同一部位的重復菌株）。根據CRE判定標準[8]確定CRKP，即亞胺培南或美羅培南最低抑菌濃度（MIC）≥4 mg/L和/或厄他培南MIC≥2 mg/L或產碳青霉烯酶。本研究質控菌株有大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705和1706，均購自上海漢尼生物技術有限公司。

1.2 儀器與試劑

VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定和藥敏系統購自法國生物梅里埃公司，藥敏紙片購自英國OXOID公司；Xba I限制性內切酶、Premix Taq購自日本TaKaRa公司，PFGE DNA Marker由寧夏疾病與預防控制中心提供；Mycycler PCR儀、CHEF-DR Ⅲ 型脈沖場電泳系統、核酸電泳儀、紫外凝膠成像及分析系統儀均為美國Bio-Rad公司；所有引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.3 細菌鑒定及藥敏試驗

利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（MALDI-TOF MS）進行菌種鑒定，VITEK-2全自動微生物鑒定儀及配套藥敏卡（AST-GN09）進行藥敏試驗，藥敏結果嚴格參照2018年版美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）標準[9]判讀。抗菌藥物MIC值采用微量肉湯稀釋法復核。WHONET 5.6軟件統計分析耐藥率。

1.4 碳青霉烯酶表型檢測

根據CLSI M100-S28推薦方法[9]，改良碳青酶烯酶滅活試驗（mCIM）聯合EDTA-改良碳青酶烯酶滅活試驗（eCIM）檢測CRKP菌株產碳青霉烯酶表型。

1.5 毒力表型檢測

拉絲試驗：待測菌株接種于血瓊脂平板，35℃培養過夜，用接種環輕輕挑起單個菌落，重復3次拉絲長度均≥5 mm，則為結果陽性，判斷菌株為高黏性菌株[10]，即為CR-hvKP菌株[11]。

1.6 耐藥基因、莢膜血清型、毒力基因檢測

PCR技術檢測103株CRKP菌株耐藥基因β內酰胺酶基因（blaSHV、blaTEM）、碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48）；6種常見的莢膜血清型（K1、K2、K5、K20、K54、K57），10種毒力基因（rmpA、Kfu、Aerobactin、

mrkD、iroN、fim-H、ent-B、alls、magA、ybtS）。引物序列、擴增條件及產物長度見表1[12-16]。陽性擴增產物送至上海生工生物工程公司測序，測序結果登錄NCBI網站進行BLAST比對。

表1 主要引物序列Table 1 Primers used in this study for amplifying relevant genes

1.7 CRKP的MLST分析

對103株CRKP菌株進行MLST，肺炎克雷伯菌的7個管家基因（rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB）引物序列 參 照MLST數據庫（https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.

html）合成，退火溫度設置為50℃。陽性擴增產物送上海生工生物工程公司測序，測序結果登錄MLST數據庫進行在線比對，將比對的等位基因編碼組合與數據庫已提交的肺炎克雷伯菌等位基因編碼組合進行對比，確定其序列型（ST）。

1.8 CRKP的同源性（PFGE）分析

對拉絲試驗陽性的菌株（CR-hvKP）進行PFGE圖譜分析同源性[17]，采用Bionumerics 7.6軟件對PFGE條帶進行聚類分析。

2 結果

2.1 CRKP菌株對抗菌藥物的耐藥性

103株CRKP菌株對臨床常見抗菌藥物表現為不同程度的耐藥，對亞胺培南、美羅培南等耐藥率為100%，對環丙沙星等耐藥率為50.5%～87.4%，對多黏菌素B耐藥率為1.0%，敏感性最好，見表2。

表2 103株CRKP菌株對抗菌藥物的耐藥率Table 2 Susceptibility of 103 strains of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae to antimicrobial agents

2.2 碳青霉烯酶的表型及耐藥基因的分子生物學檢測

2.2.1mCIM試 驗 聯 合eCIM試 驗 檢 測 103株CRKP菌株中，94株CRKP菌株產碳青霉烯酶，其中63株（67.0%，63/94）產金屬酶，31株（33.0%，31/94）產絲氨酸碳青霉烯酶。

2.2.2PCR分子生物學檢測 103株CRKP菌株中β內酰胺酶基因以blaTEM檢出率最高，為82株（79.6%），blaSHV基因62株（60.2%）；87株碳青霉烯酶基因陽性，其中NDM、KPC、OXA-48、IMP檢 出 率 分 別 為50.5%（52/103）、33.0%（34/103）、22.3%（23/103）及10.7%（11/103）。未檢出VIM基因。測序結果顯示，82株TEM基因陽性菌株全部為TEM-1型，62株SHV基因陽性為SHV-1（45.2%，28/62）、SHV-12型（33.9%，21/62）和SHV-11型（21.0%，13/62），52株NDM基因存在NDM-5亞型（80.8%，42/52）和NDM-1亞型（19.2%，10/52），42株KPC基因均為KPC-2型。103株CRKP菌株中，以NDM+TEM+SHV陽性株數最多為18.4%（19/103），攜帶KPC+TEM基因、KPC+SHV+TEM的菌株數量分別為13.6%（14/103）、12.6%（13/103）。

2.3 CRKP的MLST分析結果

103株CRKP菌 株 中 有18個ST型 別，1株因未得到完整的等位基因編號而無ST型別。ST分 型 中ST11型36株（35.3%），其 中30株 攜帶KPC-2基因，集中出現在神經外科（22.2%，8/36）、PICU（19.4%，7/36）、急 診 科（19.4%，7/36）、肝 膽 外 科（11.1%，4/36）等；ST76型23株（22.5%），有21株攜帶NDM基因（20株NDM-5，1株NDM-1），主要分布在NICU（78.3%，18/23）。

2.4 毒力表型、莢膜血清型及毒力基因檢測結果

103株CRKP菌株中有10株（9.7%，10/103）拉絲試驗陽性，為高黏液表型，即CR-hvKP菌株。莢膜血清型分型結果顯示，10株CR-hvKP菌株中，K1血清型4株（40.0%，4/10），未檢出K2、K5、K20、K54、K57血清型；有4株菌攜帶全部10種毒力基因，fim-H和entB基因陽性10株（100%），ybts基因陽性8株（80.0%）；5株NDM-5基因陽性，2株KPC-2基因，8株SHV基因，6株TEM基因，見表3。

表3 10株拉絲試驗陽性的CR-hvKP菌株PFGE、MLST莢膜血清型、碳青霉烯類耐藥基因及毒力基因等檢測結果Table 3 Prevalence of PFGE types, MLST types, K1 capsular serotype, carbapenem resistance genes, and virulence genes in 10 strains of carbapenem-resistant hypervirulent K. pneumoniae which were positive in string test

2.5 CR-hvKP的PFGE分析結果

10株CR-hvKP分為A～F 6種不同的克隆型，其中D型的3株（菌株編號2、3、8號）具有相似的圖譜，親緣性較高，該3株菌在檢出科室、檢出時間、標本類型方面均較為分散，未發現其暴發流行。其余7株分別為5種不同的克隆型（A、B、C、E、F型），見表3。

3 討論

產碳青霉烯酶是CRKP菌株對β內酰胺類包括碳青霉烯類藥物耐藥的主要原因[18]，這是對抗感染治療的嚴重挑戰。目前，臨床上檢測CRE耐藥機制的常用方法是CLSI于2017年和2018年相繼推出的mCIM和eCIM聯合試驗作為檢測腸桿菌目細菌產碳青霉烯酶的確證試驗[9]。本組資料顯示，mCIM和eCIM聯合對103株CRKP菌株的碳青霉烯酶檢出率為91.3%（94/103），其中67.0%（63/94）產金屬酶，33.0%（31/94）產絲氨酸碳青霉烯酶，提示我院的CRKP菌株大多產碳青霉烯酶，以金屬酶為主；與同時進行的PCR檢測法結果顯示金屬酶blaNDM碳青霉烯酶基因中檢出率50.5%（52/103）為最高一致；blaKPC次之（33.0%，34/103）。測序比對結果顯示，我院NDM基因存在兩個亞型，NDM-5亞型為主（80.8%），NDM-1亞型次之（19.2%）；KPC基因均為KPC-2型。即我院主要的碳青霉烯酶基因為NDM-5型，這與國內大部分地區報道的CRKP菌株中主要以產碳青霉烯酶基因型為KPC-2型不同[19-20]，但與徐旋等[21]報道的銀川地區碳青霉烯酶耐藥基因以NDM為主相符。另有研究報道稱，NDM-1型在印度[22]、新加坡[23]等國家是主要的碳青霉烯酶流行型，提示碳青霉烯酶基因具有明顯的地區差異性。本研究中KPC基因的檢出率僅次于NDM基因，表明KPC型酶也已經在我院流行傳播。

本研究對103株CRKP菌株進行了MLST，共檢出18種ST型別。結果顯示我院優勢型別為ST11型，主要以產KPC酶為主，這與我國產KPC酶的肺炎克雷伯菌主要流行型為ST11型相符[24]。結合病歷資料發現，ST11型在神經外科、PICU、急診科檢出較多，但總體呈分散流行，ST76型主要檢出時間集中于2019年4月至9月，主要集中于NICU，期間可能發生過一次暴發流行，醫院可能采用了相關防治措施，9月之后未再有菌株暴發流行。這提示我們應當及時建立一種醫院感染暴發預警系統，并有嚴格的手衛生和感染隔離措施，有研究表明通過嚴格的感染控制措施和醫護人員教育能夠成功控制菌株暴發感染[25]。

從103株CRKP菌株中篩選出10株高黏液表型菌株，檢出率為9.7%，與俞鳳[16]研究結果一致，但相較我國學者Guo等[26]報道肺炎克雷伯菌導致的侵襲性感染中有22.8%的hvKP以及韓國學者Jung等[27]報道的從菌血癥患者中分離出的肺炎克雷伯菌有42.2%為hvKP來說明顯較低，有待后續加大樣本量進一步研究。

本研究顯示103株CRKP中僅10株細菌為CR-hvKP菌株，具有拉絲試驗陽性；碳青霉烯類耐藥基因的攜帶以NDM-5為主，產NDM-5型酶；此結果與康海全[14]的研究結果，即CR-hvKP菌株的耐碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機制是產KPC-2型酶不同。目前莢膜血清型已報道了80多種的分型[28]，常見的有K1、K2、K5、K20、K54和K57等，其中最常引起KLA的是K1和K2型。本研究結果顯示，K1血清型檢出4株，檢出率為40.0%（4/10），與國內報道的23.8%的K1型和42.9%的K2型有所不同[26]，需繼續監測更多的樣本來明確莢膜血清分型。

本研究顯示10株CR-hvKP中分別被檢出100%和60%的 菌 株 含fim-H基 因 和Kfu基 因，50%菌株還含有mrkD的基因。文獻報道上述基因均與肺炎克雷伯菌入侵機體后細菌黏附機體的Ⅰ型和Ⅲ型菌毛有關，此被認為是細菌主要的黏附結構，如Ⅰ型菌毛（fim-H和Kfu基因）與泌尿道感染密切相關，Ⅲ型菌毛（mrkD）與細菌生物膜親和性最好[29]。本研究中，fim-H基因和Kfu基因檢出率較高，能夠與機體內的含甘露糖的蛋白相結合，有助于在泌尿道形成生物膜并定植[15]，這與Ⅰ型菌毛在肺炎克雷伯菌中普遍存在相一致。同時檢測還發現肺炎克雷伯菌在宿主體內獲取鐵的方式即通過細菌自身的鐵載體分泌相關基因ent-B和ybtS基因等有關；對10株CR-hvKP中ent-B和ybtS基因的檢測，分別達100%和80%，如此高的檢出率，與其他文獻報道亦較一致[30]。

綜上所述，本院臨床分離的CRKP菌株對常見抗生素的耐藥率均較高且多為MDR菌，其對碳青霉烯類的主要耐藥機制是產NDM-5型金屬酶，ST11型肺炎克雷伯菌為我院主要的流行克隆。9.7%的CR-hvKP菌株的檢出率，提示我院已出現高毒力的碳青霉烯類耐藥流行菌株，當引起臨床和院感相關部門的重視，后續應擴大樣本進一步探查傳播來源及途徑，防止暴發流行。