基于猴痘病毒A27L蛋白的間接ELISA抗體檢測方法的建立

朱俊達，王 爽，任書凝，張子卉，李雅睿，劉國瑞，吳文學，王永強，彭 辰

(中國農業大學動物醫學院，北京 海淀，100193)

猴痘(Monkeypox)是由屬于痘病毒科(Poxviridae)正痘病毒屬的猴痘病毒(Monkeypox virus,MPXV)引起的人獸共患傳染病[1]。1958年，MPXV在丹麥哥本哈根的實驗用恒河猴中首次發現[2]，因此被命名為猴痘病毒。然而，MPXV的自然宿主不明，推測可能是野生嚙齒類動物和其他小型哺乳動物[3]。正痘病毒屬病毒還包括天花病毒(Variola virus，VARV)、痘苗病毒(Vaccinia virus,VACV)等，人感染猴痘的癥狀與天花極為相似，但病死率較低[1，4]。20世紀70年代，人群中散發性MPXV病例在幾個非洲國家首次發現[5-6]，在過去20年間該病毒在非洲大陸逐漸流行，猴痘感染人的病例頻繁報道[7-8]，2003 年在非洲以外的國家美國首次發現猴痘病例[9]。自2022年5月以來，全球MPXV病例突然呈現急劇增加的趨勢，世界衛生組織(World Health Organization，WHO)因此宣布猴痘暴發為全球衛生緊急事件，并將猴痘的全球公共衛生風險評估為“中度風險”[10]。因天花疫苗可對猴痘病毒產生交叉免疫力，此次猴痘疫情暴發的主要原因可能是停止接種天花疫苗導致人群免疫力下降[11]。截止目前，本輪猴痘疫情導致的全球感染人數已經超過6萬人，并導致數十人死亡，感染人數仍在不斷增加。2022年9月，中國大陸首次報告人感染猴痘輸入病例，猴痘疫情對人類公共衛生安全已經造成嚴重威脅，因此，對人群和不同動物中MPXV的檢測和流行病學監測刻不容緩。

對MPXV感染病例的診斷是疫情防控過程中的關鍵環節，需要快速、準確的檢測技術作為支持。目前，針對MPXV的檢測方法大多操作復雜，成本較高，且往往只針對一種動物，無法滿足MPXV臨床診斷的需要。因此，建立一種快速、準確、針對多種不同動物體內MPXV血清抗體的間接ELISA抗體檢測方法，對人群和不同動物中MPXV的檢測和流行病學調查至關重要。由于MPXV 的分離培養需要生物安全III級實驗室，很難直接獲取猴痘感染動物血清，通常來說MPXV的血清抗體檢測方法難以建立并進行評價。本研究選擇與VACV-WR148蛋白氨基酸序列相似度很高的MPXV-A27L蛋白作為包被抗原，使用VACV陽性血清成功構建了MPXV的間接ELISA抗體檢測方法，并選用可以結合大多數哺乳動物血清抗體的HRP標記Protein A/G作為酶標二抗，建立的MPXV間接ELISA檢測方法具有良好的適應性，為MPXV的臨床檢測和流行病學調查提供了材料和技術儲備。

1 材料與方法

1.1 主要材料 pET-32a表達載體和DH5α感受態細胞由本實驗室保存；T4 DNA連接酶、內切酶EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ，均購自NEB；Rosetta感受態細胞，購自康為世紀生物科技股份有限公司；鎳瓊脂糖填料，購自北京韋氏博慧色譜科技有限公司；HRP標記Protein A/G，購自賽默飛世爾科技公司；VACV、山羊痘病毒(Goatpox virus,GTPV)、綿羊痘病毒(Sheeppox virus,SPPV)和牛結節性皮膚病病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)陽性血清，均由本實驗室保存。

1.3 MPXV-A27L的原核表達與純化

1.3.1 MPXVA27L基因合成與陽性克隆質粒構建 由于目前人群和動物群中流行的MPXV為西非分支，因此從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)查找并下載MPXV西非分支的代表性毒株MPXV-SIE(GenBank登錄號：AY741551)的序列，選擇MPXVA27L基因序列并交付生工生物工程(上海)股份有限公司進行密碼子優化和基因合成。使用酶切連接的方法將合成的A27L基因序列連接到pET-32a載體上，構建pET-32a-A27L表達載體。將pET-32a-A27L表達載體轉化至DH5α感受態細胞，挑取單克隆并測序，提取測序正確的陽性克隆質粒轉化至Rosetta感受態細胞中。

1.3.2 pET-32a-A27L蛋白小試誘導表達 取50 μL 菌種原液加入到5 mL含抗生素的LB培養基中，37 ℃、250 r/min 培養8～12 h。將500 μL菌液加入到含5 mL LB培養基的15 mL 離心管中，37 ℃振蕩培養至OD值達0.6。取200 μL菌液作為未誘導的對照組，剩余菌液加入IPTG誘導劑至終濃度1 mmol/L作為試驗組，2個組繼續于37 ℃、200 r/min振蕩培養3 h。分別取200 μL誘導或未誘導菌液，12 000 r/min離心1 min收獲沉淀，用50 μL 1× Loading重懸，混勻，100 ℃ 5 min。12 000 r/min離心1 min，取上清，進行SDS-PAGE電泳。

1.3.3 pET-32a-A27L擴大培養及蛋白純化 將活化后的甘油菌按1∶100接種于500 mL含抗生素的LB培養基中，37 ℃振蕩培養至OD值達0.6。加入500 μL IPTG，37 ℃、220 r/min誘導4 h后，收集菌體。加入25 mL PBS重懸菌體并超聲波裂解6 min，裂解時置于冰上，功率為200～300 W，工作3 s，間隔6 s。10 000 r/min離心10 min，去上清，加入25 mL Washing buffer重懸沉淀并超聲波裂解3 min。重復上述步驟1次。10 000 r/min離心10 min，加入25 mL Resuspension buffer重懸沉淀并超聲波裂解3 min。10 000 r/min離心10 min，加入20 mL 8 mol/L尿素重懸沉淀，并超聲波裂解1.5 min。10 000 r/min離心10 min，取上清過鎳層析填料，4 ℃搖床50 r/min，11～12 h。分別加入20 mL的20、50 mmol/L和300 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白，透析并復性目的蛋白，SDS-PAGE電泳分析蛋白的純度和濃度。

1.4 間接ELISA檢測方法的建立和優化

1.4.1 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的優化 采用方陣滴定法，分別使用免疫/未免疫VACV的兔血清作為陽性/陰性血清，以重組蛋白MPXV-A27L作為包被抗原，將MPXV-A27L用包被緩沖液稀釋，先將抗原稀釋至1.0 μg/mL，再2倍倍比稀釋至0.125 μg/mL，試驗共設4個稀釋度，各個稀釋度分別包被同一個豎行，每孔100 μL。試驗設3個重復，一抗為不同稀釋度的血清，血清稀釋度分別為1∶100、1∶200、1∶400，測定每個條件下陰陽性對照血清的OD450值，HRP標記的Protein A/G為二抗，TMB為顯色液，2 mol/L H2SO4溶液為終止液，反應結束后測定OD450值并比較各組P/N值，確定最佳抗原包被濃度和血清稀釋度。

1.4.2 最佳封閉條件的優化 采用方陣滴定法，以0.25 μg/mL的MPXV-A27L重組蛋白為包被抗原；以5%脫脂乳、1% BSA或2% BSA為封閉液分別孵育60 min和120 min，VACV陽性血清為一抗，其他反應條件同1.4.1，反應結束后測定OD450值并比較各組P/N值，確定最佳封閉液及封閉時間。

這種基于經驗決策路徑下的偵查決策，雖然不能涵蓋偵查決策的全部，卻是偵查決策的大部分路徑，這種經驗決策路徑決定了偵查決策不可能完全是在絕對理性的基礎上做出，即偵查決策路徑是有限理性的。

1.4.3 最佳一抗孵育時間和二抗稀釋度的優化 以1.4.1和1.4.2優化獲得的最佳條件包被抗原并進行封閉。分為3個組，加入一抗后分別孵育30、45 min和 60 min。以HRP-Protein A/G抗體作為二抗，先用抗體稀釋液將二抗稀釋成1∶5 000，再倍比稀釋至1∶20 000，共設3個稀釋度，各稀釋度取100 μL加入酶標板中，每個稀釋度二抗設3個重復，其他反應條件同1.4.1。反應結束后測定OD450值并比較各組P/N值，確定最佳一抗孵育時間和二抗稀釋度。

1.4.4 最佳二抗孵育時間的優化 以1.4.1、1.4.2和1.4.3中優化獲得的最佳條件進行抗原包被、封閉、血清孵育，按照優化后的濃度加入二抗后再分成3個組，分別于37 ℃孵育30、45 min和60 min，每組3個重復，其他反應條件同1.4.1。反應結束后測定OD450值并比較各組P/N值，確定最佳二抗孵育時間。

1.6 特異性試驗 利用本研究建立的間接ELISA方法檢測GTPV、SPPV和LSDV陽性血清，同時設VACV陰性和陽性血清作為對照，以評估本研究建立的間接ELISA方法的特異性。

1.7 重復性試驗 分別包被3個批次的MPXV-A27L蛋白，每個批次內設4個重復，隨機對6份兔血清進行檢測，分析各批次內以及每個批次間的變異系數，評估本方法的重復性。

1.8 敏感性試驗 隨機選取3份VACV陽性血清，并進行1∶102～1∶106的稀釋，其余條件按1.4中確定的最佳反應條件進行試驗，分別進行ELISA檢測，分析各稀釋度的OD450值評估本方法的敏感性。

2 結果

2.1 MPXV-A27L與VACV-WR148蛋白相似度比較 對MPXV-A27L與VACV-WR148蛋白的氨基酸序列相似度進行比較，兩者的氨基酸序列相似度達96.7%(圖1)，考慮到直接獲取猴痘感染動物血清的困難性，在使用MPXV-A27L蛋白作為包被抗原時，可以使用VACV陽性血清建立間接ELISA抗體檢測方法。

圖1 MPXV-A27L與VACV-WR148氨基酸序列相似度比較

2.2 MPXV-A27L的原核表達與純化 取菌種原液進行鑒定，在誘導后包涵體表達了分子量大小為110 kDa的蛋白，與預期結果基本一致，表明pET-32a-A27L原核表達系統構建成功。擴大培養后進行蛋白純化，8 mol/L尿素溶解沉淀離心取上清為最終收集液，純化后的蛋白條帶與預期大小一致，表明pET-32a-A27L純化完成(圖2)。

圖2 MPXV-A27L蛋白的SDS-PAGE分析

2.3 間接ELISA檢測方法的建立和優化

2.3.1 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的優化 MPXV-A27L最佳抗原包被濃度為0.25 μg/mL，最佳血清稀釋度為1∶200，在此條件下P/N值最大，為18.116(表1)。

表1 最佳包被抗原濃度與血清稀釋度的優化

2.3.2 最佳封閉條件的優化 在3種封閉液以及2個封閉時間中，1% BSA為封閉液、封閉1 h效果最佳，此時P/N值為13.139(表2)。

表2 最佳封閉液及封閉時間的優化

2.3.3 最佳一抗孵育時間和二抗稀釋度的優化 一抗孵育30 min，二抗1∶20 000稀釋時最佳，此時P/N值為7.158(表3)。

表3 最佳一抗孵育時間及二抗稀釋度的優化

2.3.4 最佳二抗孵育時間的優化 二抗孵育30 min為最佳，此時P/N值為6.817(圖3)。

圖3 最佳二抗孵育時間的優化

2.5 特異性試驗 VACV陽性對照血清的OD450值的平均值1.284>0.316，VACV陰性對照血清的OD450值的平均值0.161<0.262；此時GTPV陽性血清、SPPV陽性血清和LSDV陽性血清的OD450值均<0.262(圖4)。

圖4 間接ELISA檢測方法的特異性試驗

2.6 重復性試驗 同一批次包被的孔板的4次檢測結果變異系數為2.75%～7.45%，3個批次間的變異系數為6.55%～9.59%(表4)。說明本ELISA抗體檢測方法具有良好的批內及批間重復性。

表4 間接ELISA檢測方法的重復性試驗

2.7 敏感性試驗 3份陽性血清均在1∶105稀釋度時檢測結果為陰性，該方法可檢測到血清最大稀釋倍數為1∶104(圖5)，說明本方法具有較好的敏感性。

圖5 間接ELISA檢測方法的敏感性試驗

3 討論

猴痘是由MPXV引起的一種人獸共患病，推測其自然宿主可能是嚙齒動物和其他小型哺乳動物，可在人群間傳播，2022年以前，猴痘作為一種地方性流行病主要流行于非洲中、西部地區[3]。2022年5月起，猴痘疫情在全球多個非猴痘疫情流行地區暴發[12]，病例數迅速增長，引起全球高度關注。本次猴痘疫情牽涉國家之廣，病例之多，增長之快，從未有之。MPXV正以遠超預估的速度進化[13]，由于人獸共患病病原體在人類中傾向于向更具傳染性的方向進化，MPXV基因組與天花病毒又高度相似，研究人員擔心MPXV基因突變后可對全球構成類似天花一樣的威脅。猴痘疫情對人類公共衛生安全已經造成嚴重威脅，因此，對人群和動物中MPXV的檢測和流行病學調查刻不容緩。

猴痘主要流行于動物中，有至少5種猴類以及其他靈長類和嚙齒類動物可以感染猴痘，其中松鼠是人類MPXV的重要宿主和傳染源之一[14]?；贛PXV感染的臨床表現和流行病學特征，將其分為剛果盆地分支和西非分支2種不同的病毒分支。目前人群和動物群中流行的MPXV為西非分支，代表性毒株為Sierra Leone株(MPXV-SIE)。由于MPXV引起的臨床癥狀與其他痘病毒難以鑒別，根據臨床表現確診猴痘非常困難，因此作為疫情防控過程中的關鍵環節，對MPXV進行診斷需要快速、準確的檢測技術作為支持，為MPXV的監測和流行病學調查等工作提供幫助。

目前，針對MPXV的檢測方法主要包括電子顯微鏡檢測MPXV[15]、MPXV實時熒光定量技術[16-19]、MPXV高通量測序技術[20]、MPXV環介導等溫擴增技術[21-22]、MPXV分離培養、MPXV血清抗體檢測[23]等，但目前的檢測方法各有其不足之處，無法滿足MPXV臨床診斷的需要。其中電子顯微鏡檢測MPXV周期較長且操作復雜，設備昂貴；MPXV實時熒光定量技術只能針對病毒感染過程中的病原核酸進行檢測，無法滿足大規模流行病學調查的需要；MPXV高通量測序技術成本較高，對測序數據的處理能力要求較高，不適合大規模檢測；MPXV環介導等溫擴增技術在實驗室環境中易形成氣溶膠，往往導致假陽性結果出現；MPXV分離培養需要生物安全III級實驗室進行，且對操作人員要求很高；由于很難直接獲取猴痘感染動物血清，MPXV血清抗體檢測方法難以建立并進行評價，更無法對多種不同動物體內的血清抗體進行檢測。因此，建立一種快速、準確、針對多種不同動物體內MPXV血清抗體的間接ELISA抗體檢測方法，對人群和動物中MPXV的檢測和流行病學調查至關重要。

MPXV病毒顆粒較大，直徑為230～300 nm，呈磚狀或菠蘿果狀。MPXV-A27L蛋白是MPXV的一種重要結構蛋白，也是中和抗體的主要靶點之一，在VACV中存在MPXV-A27L的同源蛋白VACV-WR148。本研究通過比對發現，MPXV-A27L蛋白與VACV-WR148蛋白的氨基酸序列相似度非常高。由于MPXV相關研究需要在生物安全III級實驗室中開展，ELISA試劑盒的研發、批量生產和應用所需的病原及感染動物血清很難獲得，因此本研究創新性地以MPXV-A27L蛋白作為包被抗原，使用VACV陽性血清建立MPXV的間接ELISA抗體檢測方法。由于MPXV可以感染多種靈長類和嚙齒類哺乳動物[24]，現有的MPXV抗體檢測試劑盒往往只能針對一種動物的血清開展檢測，因此為了對不同動物群中MPXV感染情況進行流行病學調查，本研究參考正痘病毒屬病毒通用ELISA抗體檢測方法[25-26]，選用HRP標記的Protein A/G作為酶標二抗。Protein A/G分別來源于金黃色葡萄球菌和鏈球菌，其可以結合大多數哺乳動物血清抗體，從而適用于多種哺乳動物的血清抗體檢測，滿足了臨床中對不同動物群中MPXV的檢測和流行病學調查的要求。

基于以上背景，本研究首先構建了MPXV-A27L蛋白的原核表達系統，并以此作為包被抗原，建立了MPXV間接ELISA抗體檢測方法，并確定了ELISA最佳反應條件：抗原包被濃度為0.25 μg/mL；1% BSA封閉1 h；待檢血清1∶200稀釋，37 ℃孵育30 min；酶標二抗1∶20 000稀釋，孵育30 min；底物顯色10 min。待檢血清樣品OD450值 > 0.316時判定為陽性，OD450值<0.262時判定為陰性，OD450值介于0.262～0.316時則判定為可疑。特異性試驗結果顯示，該檢測方法不與山羊痘病毒屬GTPV、SPPV和LSDV的陽性血清發生交叉反應；重復性試驗結果顯示，本方法批內變異系數為2.75%～7.45%，批間變異系數為6.55%～9.59%，表明本方法重復性良好；敏感性試驗結果顯示，該方法可檢測到血清最大稀釋度為1∶104。本研究建立的MPXV間接 ELISA 抗體檢測方法具有良好的特異性、重復性和敏感性，為MPXV的臨床檢測和流行病學調查提供了材料和技術儲備，對于猴痘疫情的防控具有重要作用。