河北省2株鴨圓環病毒全基因組測序與遺傳進化分析

李馨月，王文靜，張宗淑，王 超，張 鐵

(河北農業大學動物醫學院，河北 保定 071000)

鴨圓環病毒(Duck circovirus，DuCV)作為圓環病毒科圓環病毒屬的成員之一[1]，是一種無囊膜、二十面體對稱的單股環狀DNA病毒[2]。作為已知體型最小感染鴨的病毒[3]，DuCV主要引起感染鴨的法氏囊淋巴細胞減少、損傷、壞死，組織細胞增生等現象[4-5]。DuCV輕則會導致感染鴨脫毛，重則會造成精神沉郁、呼吸困難、貧血、消瘦、營養不良等，甚至導致產蛋鴨的生產性能降低[6]。DuCV還能夠直接破壞鴨的免疫系統[7]，造成免疫器官受損，體液免疫和細胞免疫功能顯著降低，同時引起免疫抑制[8]，增加其與細菌或其他病毒混合感染和繼發感染的可能性，使病鴨的死亡率升高。有研究表明，已經感染DuCV的鴨更容易患上鴨病毒性肝炎、鴨疫里氏桿菌病、鴨瘟、大腸埃希菌病等病癥[9]。

DuCV最早于2003年被德國學者Hattermann等從番鴨的法氏囊組織中發現并報道[10]，2006年在我國臺灣地區首次檢測到DuCV感染[11]，而DuCV全基因序列在我國大陸地區的首次成功克隆則是在2008年[12]，隨后山東、福建、浙江、四川、江蘇、廣東等地陸續有相關研究，但對于河北地區DuCV的研究尚不多見。近年來，隨著DuCV的廣泛流行，混合感染病例也逐漸增多。

本試驗旨在通過分析2株臨床獲取的DuCV的全基因序列及遺傳進化特點，了解河北省臨床感染的DuCV毒株的基因型及遺傳變異情況，以期為DuCV感染的實驗室診斷和科學防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 病料 由河北省鴨場送檢的48只以脫毛、生長遲緩為特征的病死鴨法氏囊，-80 ℃保存備用。

1.2 主要試劑 DH5α感受態細胞和病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，均購自天根生化科技(北京)有限公司；pMD20-T Vector，購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA 2 000 Marker和SanPro 柱式DNA膠回收試劑盒，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；2×TaqPlus Master Mix Ⅱ(Dye Plus)，購自諾唯贊生物科技(南京)股份有限公司。

1.3 主要儀器 生化培養箱(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)，電泳儀(北京市六一儀器廠)，PCR儀(伯樂生命醫學產品有限公司)，全自動凝膠成像儀(北京賽智創業科技有限公司)，臺式恒溫振蕩器(上海精宏實驗設備有限公司)，渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.4 試驗方法

1.4.1 DNA提取 將處理好的樣品，按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書進行操作，提取DNA。

1.4.2 引物設計與合成 根據GenBank中DuCV(登錄號：KC460534)的全基因序列，應用Primer(Version 5.0)軟件分析并設計特異性引物DuCV-F/R。參照李金麗[13]設計的引物DuCV-Q-(1～4)-F/R，用于DuCV全基因組核苷酸的擴增。引物序列見表1，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR引物

1.4.3 DuCV檢測 以1.4.1中提取的DNA為模板，用DuCV-F/R引物進行PCR擴增。PCR反應體系(25 μL)：12.5 μL Mix，10 μL ddH2O，上、下游引物各0.5 μL，模板1.5 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共34個循環；72 ℃延伸5 min。擴增完成后，取5 μL PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統中觀察并記錄結果。

1.4.4 DuCV基因組全長的PCR擴增、克隆及測序 選取2株1.4.3中結果呈陽性的DNA為模板，用DuCV-Q-1-F/R、DuCV-Q-2-F/R、DuCV-Q-3-F/R、DuCV-Q-4-F/R共4對引物分別進行PCR擴增。PCR反應體系及PCR反應程序同1.4.3，退火溫度根據Tm值改變。擴增完成后，取5 μL PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統中觀察并記錄結果。PCR產物純化后連接到pMD20-T載體，轉化DH5α感受態細胞，經藍白篩選，挑取單個菌落于含氨芐抗性的LB液體培養基中過夜培養，提取質粒經PCR鑒定，將陽性質粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.4.5 DuCV全基因組序列分析 將測序結果運用DNASTAR軟件進行整理與拼接，獲得2株DuCV全基因組序列。運用BLAST、DNAMAN和MEGA 7.0軟件，將獲得的2株DuCV全基因組序列與參考株基因組序列比對，進行同源性比較和基因進化樹分析。本試驗用于核酸序列分析的參考毒株見表2。

表2 用于基因序列比較的參考毒株

2 結果

2.1 DuCV檢測 對48例病死鴨病料組織DNA樣品進行PCR擴增，產物大小與目的片段預期大小相符(圖1)，DuCV陽性率為72.92%(35/48)。

圖1 部分DNA樣品鴨圓環病毒的PCR檢測

2.2 分段PCR擴增 PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，分段擴增的條帶大小與目的片段預期大小相符(圖2)。本試驗成功擴增選取的2株DuCV的全基因序列，錄入GenBank，登錄號分別為MW255979和MW255980。MW255979全基因序列長為1 995 bp，與已報道的中國山東株GU131340和中國廣西株KC460534長度一致；MW255980全基因序列長為1 993 bp，與已報道的中國北京株HM162348、中國山東株MF627688、中國廣西株MK814578、韓國株JQ740360和中國臺灣株KP229366長度一致。

圖2 2株鴨圓環病毒分段PCR擴增

2.3 全基因組同源性比較 應用DNASTAR軟件中的MegAlign進行同源性比較，結果如圖3所示，2株DuCV基因序列的同源性為97.9%；2株DuCV全基因序列與14株國內外參考株序列同源性為82.9%～98.7%，可細分為2個數值段，一個為94.3%～98.7%，另一個為82.9%～83.4%；其中MW255979與中國廣西株MK814578核苷酸同源性最高，為98.7%，與中國山東株EU022374和中國廣西株JX241045核苷酸同源性最低，為83.0%；MW255980與韓國株JQ740360核苷酸同源性最高，為98.6%，與中國山東株EU022374核苷酸同源性最低，為82.9%。

圖3 2株鴨圓環病毒和參考毒株基因核苷酸序列同源性比較

2.4 全基因組遺傳進化分析 采用MEGA 7.0軟件對獲得的2株DuCV全基因序列與14株參考序列繪制遺傳進化樹，結果如圖4所示，DuCV可以分為2個基因型，分別是以中國廣西株MK814578為代表的DuCV-1型和以中國臺灣株AY394721為代表的DuCV-2型。其中，DuCV-1型又可以分為2個亞型，MW255979毒株、MW255980毒株和中國北京株HM162348、中國山東株MF627688、中國廣西株MK814578、中國廣西株KC460528、韓國株JQ740360均屬于同一亞型；MW255979株與中國廣西株MK814578遺傳距離最為接近，MW255980株與韓國株JQ740360遺傳距離最為接近；MW255979和MW255980均屬于DuCV-1型，與屬于DuCV-2型的中國臺灣株AY394721、中國山東株EU022374、中國廣西株JX241045和中國福建株KF726087關系較遠。

圖4 DuCVs基因組系統進化樹

3 討論

本試驗擴增得到的2株DuCV全基因組內均包括6個大于200 bp的開放閱讀框(Open reading frames，ORFs)：位于正鏈的ORF V1、V2、V3，及位于負鏈的ORF C1、C2、C3。MW255979毒株：ORF V1(49～927 bp)、ORF V2(1 370～1 519 bp)、ORF V3(1 661～1 810 bp)、ORF C1(1 932～1 159 bp)、ORF C2(1 741～1 379 bp)和ORF C3(400～164 bp)。MW255980毒株：ORF V1(49～927 bp)、ORF V2(1 368～1 517 bp)、ORF V3(1 659～1 916 bp)、ORF C1 (1 930～1 157 bp)、ORF C2(1 739～1 377 bp)和ORF C3(400～134 bp)。

2株DuCV全基因序列的ORF V1編碼氨基酸長度為292 aa的Rep蛋白，是與病毒復制有關的蛋白。在具有滾環復制特征的保守基序(50TPHLQGF56和91YCAKE95)和可啟動滾環復制過程中酶促反應的dNTP結合域(14FTINNP19、167GPPGTGKSR175和206DDFYGW211)編碼區內，2株DuCV均未出現核苷酸插入或缺失。位于圓環病毒負義鏈上的ORF C1編碼長度為257 aa的Cap蛋白，作為病毒的核衣殼蛋白，其具有良好的免疫原性[14]。在2株DuCV基因組ORF V1的5′端和ORF C1的3′端之間均存在莖環結構，目前被認為是DuCV復制的起點。ORF V1的3′端與ORF C1的5′端之間存在1個由正向重復4次的堿基序列(下劃線標記)組成的四重串聯重復序列(QTR)：CACTTGGCAGGGTATTACACTTGG-GCAGCTCGG，推測其可能作為啟動包裝過程的信號。現有研究表明，OTR特異的存在于DuCV基因組中，在調節Rep和Cap的表達中有重要作用[15]。位于ORF V1的互補鏈上的ORF C3編碼長度為79 aa的蛋白，是目前已知的DuCV唯一具有誘導細胞凋亡活性的病毒蛋白[16]。2株DuCV的ORF C3與屬于DuCV-2型的中國臺灣株AY394721、中國福建株KF726087、中國山東株EU022374和中國廣西株JX241045的ORF C3具有顯著差異，與報道相符合[17]，該研究還表明2個基因型ORF C3 C端的差異氨基酸序列對于ORF C3胞核定位與凋亡活性的調控有重要意義。

由于沒有普遍適用的體外培養DuCV的方法，且對其致病機理仍不明確，尚未有商品化的疫苗出現，并且尚未發現有效治療藥物。目前對于DuCV的防治手段主要集中在預防層面，通過提高鴨群的飼養管理水平，增強鴨群的免疫能力。現有關于河北地區DuCV毒株的報道少之又少，對于DuCV基因組的分析研究主要集中于廣西、山東等地，本試驗通過對河北地區臨床送檢病料中選取的2株DuCV基因組進行測序，并進行遺傳進化分析，發現獲得的2株DuCV全基因序列與近年來我國大陸地區臨床所獲得的DuCV-1型毒株相比，基因型未發生明顯突變，為進一步研究DuCV基因提供了數據支持。要更全面地了解河北地區DuCV流行的基因型現狀，還需進一步擴大樣品采集范圍加以驗證。