感染犬耳的杜馬奈瑟菌株的分離與鑒定

趙一寧，陳新延，王麗揚，沈小蘭，王彥紅

(1. 揚州大學獸醫學院，江蘇 揚州 225009；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇 揚州 225009；3. 江蘇省泰州興化市合陳畜牧獸醫站，江蘇 興化 225733)

奈瑟菌屬(Neisseria)為革蘭陰性菌，屬于奈瑟菌科，奈瑟菌目。迄今為止，已報道的奈瑟菌約有30種[1]，雖然已有從其他哺乳動物或環境中分離出該菌的報道[2]，但該菌常被認為僅限于人類。這類微生物大多定植于黏膜表面，通常不會引起明顯的病理表現，也被認為是宿主正常菌群的組成部分[3]。然而隨著部分種屬的進化，開始出現導致人類疾病的2種典型病原體:淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)和腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitides)[4]。而在動物上，奈瑟菌已被確定為犬和貓正常口腔菌群的一部分，并作為繼發于動物咬傷動物和人類后傷口的重要病原體[5]。在已經報道的關于動物感染奈瑟菌的病例中，并未見到耳道感染病例，本試驗通過對患犬耳道分泌物進行細菌分離，得到1株細菌，經鑒定為杜馬奈瑟菌(Neisseriadumasiana)，通過對其致病性、藥物敏感性進行探究，為臨床診治此類細菌感染提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 病例背景 2019年9月，揚州大學動物醫院接診了1只8歲的薩摩耶犬，臨床檢查發現耳道有較多的分泌物，具有惡臭味，癢感明顯，隨后使用無菌棉簽采集患犬內耳道分泌物留備病原檢測。

1.2 細菌分離 在超凈工作臺內將無菌棉簽刮取的患犬耳道分泌物接種于綿羊血平板，置于37 ℃恒溫培養箱培養24 h，將分離到的菌株分別純化至綿羊血平板和麥康凱平板。24 h后觀察生長狀態，同時挑取單菌落進行革蘭染色，用奧林巴斯生物顯微鏡觀察結果。

1.3 生化試驗 用接種針無菌挑取純化后的菌落接種于葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、還原硝酸鹽、普通瓊脂等一系列奈瑟菌屬鑒定生化反應管中，37 ℃培養48 h后觀察結果。

1.4 16S rDNA鑒定 通過煮沸裂解法制備分離菌株的DNA模板，按照寶生物工程(大連)有限公司16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit方法用DNA擴增儀進行PCR擴增，將擴增產物用1%瓊脂糖凝膠在凝膠電泳儀進行電泳，其余擴增產物送至南京金斯瑞生物科技公司測序。測序結果在NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST)搜索比對，鑒定分離菌。

1.5 小鼠人工感染試驗 將6只6周齡BALB/c小鼠(購自揚州大學獸醫學院比較醫學中心)隨機分為2個組，分別為感染組和對照組，每組3只。取分離菌株37 ℃搖菌16 h，菌液濃度參照參考文獻[6]調整為5×109CFU/mL，感染組每只小鼠腹腔注射0.1 mL菌液，而對照組每只小鼠腹腔注射0.1 mL生理鹽水。兩組置于相同飼養環境中，每日觀察小鼠狀態。

1.6 藥敏試驗 采用紙片擴散法進行藥敏試驗，藥敏片和判定標準來自杭州微生物試劑有限公司，先挑取分離菌涂布于血平板上，再貼上藥敏片，37 ℃培養24 h后讀取結果。

2 結果

2.1 細菌分離 將患犬的耳道分泌物接種于綿羊血平板37 ℃培養24 h后，長出邊緣整齊、圓形隆起的不溶血灰白色菌落(圖1)，該分離菌株不能在麥康凱平板上生長。革蘭染色結果顯示，分離菌株為陰性雙球菌(圖2)。

圖1 分離菌培養形態

圖2 分離菌鏡檢結果(1 000×)

2.2 生化試驗 結果顯示，該分離菌株可以發酵葡萄糖、麥芽糖，不能發酵蔗糖，能還原硝酸鹽，普通瓊脂反應為陰性，經驗證該分離菌株沒有運動能力。此結果與奈瑟菌生化特性基本一致。

2.3 16S rDNA鑒定 分離菌株DNA模板經PCR擴增和電泳出現了600 bp左右條帶(圖3)，擴增產物經測序，并在NCBI網站BLAST中比對，結果顯示，與杜馬奈瑟菌KY417830.1具有99.6%的同源性，確定該分離菌株為杜馬奈瑟菌。

圖3 16S rDNA基因的PCR擴增

2.4 小鼠人工感染試驗 人工感染18 h后，對照組小鼠未見異常，感染組3只小鼠均死亡。感染組小鼠剖檢變化為肝色淡，脾臟腫大，心肌表面有較多白色炎性滲出，腸腔積液(圖4)。肝臟觸片經美蘭染色，顯微鏡觀察可見藍色雙球菌(圖5)，與分離菌鏡檢結果一致。

圖4 小鼠人工感染試驗剖檢結果

圖5 攻毒小鼠肝觸片美蘭染色結果(1 000×)

2.5 藥敏試驗 結果顯示，分離菌株對頭孢曲松鈉、美洛西林、頭孢噻肟、復方新諾明、氟苯尼考、慶大霉素、丁胺卡那、諾氟沙星、阿莫西林、多西環素、多黏菌素B、頭孢哌酮/舒巴坦普生、左氧氟沙星、新霉素、妥布霉素、鏈霉素和卡那霉素共17種抗菌藥敏感，僅對環丙沙星表現中介。

3 討論

本試驗從患犬的耳道分泌物中分離出1株細菌，通過對菌株的培養形態、生化特性和16S rDNA基因序列的分析，確認分離菌株為奈瑟菌屬中的杜馬奈瑟菌。奈瑟菌屬是造成人類發病和死亡的重要原因之一[7]，在動物上的報道則較為少見，致病機制也尚不明確，根據目前的研究進展，雖然大多數奈瑟菌是無害的共生菌，但在某些特定的情況下，可能會發生由共生菌到病原體的轉變，并且在組織器官中占據、生存和繁殖，導致嚴重的感染[8]。目前已經報道的病例大多數都與犬貓口腔中的奈瑟菌具有相關性，已知的包括寵物犬被其他犬咬傷造成的杜馬奈瑟菌引起的皮膚感染[9]，人被貓咬傷后的創口感染[10]等，在這之中最常見的從動物咬傷的傷口中培養出的奈瑟菌包括犬奈瑟菌(Neisseriacanis)、動物口腔奈瑟菌(Neisseriaanimaloris)、動物咬傷奈瑟菌(Neisseriazoodegmatis)和編織奈瑟菌(Neisseriaweaveri)[2]。杜馬奈瑟菌則為近幾年從犬的唾液中分離鑒定出的新種[11]，除此以外，在異物造成口腔損傷、皮膚黏膜損傷的情況下，該細菌很可能會穿透黏膜的自然保護屏障，從而進入到其他組織中造成持續感染[9]。因此在有創口損傷時，需要及時進行清創消毒處理，避免動物的抓咬舔舐造成重復感染。本次致病性試驗發現，分離菌株經腹腔注射人工感染小鼠可致其死亡，同時造成內臟器官腫大，引起炎癥反應，雖然目前關于犬奈瑟菌感染的報道較少，但其在人和動物中表現出的危害性應該得到足夠重視同時加以防范。

本試驗中患病薩摩耶犬的耳道感染奈瑟菌的原因尚未可知，推測可能由于其好動的天性導致與其他犬類抓咬所致，治療時可將患犬發病耳道內毛發剃除后，采用消毒水進行沖洗消毒，隨后根據藥敏試驗的結果選取頭孢曲松鈉肌內注射3 d，同時用頭孢曲松鈉配制藥膏外敷，通過內外兼用達到治療的目的。