全懸浮馴化MDBK細胞應用于牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯滅活疫苗的效果評估

楊青春，徐 凌，劉國英，范秀麗，王秉昆，王 凱，李曉燕 ，李 超，田志輝，陳 堅，趙麗霞，宋慶慶

(1.金宇保靈生物藥品有限公司，內蒙古 呼和浩特 010030；2. 內蒙古醫科大學附屬醫院，內蒙古 呼和浩特 010050)

牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea,BVD)和牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是嚴重危害牛群健康的病毒性傳染病，給養殖業帶來很大危害[1-6]。研究發現，牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)共同感染健康細胞與只感染1種病毒相比會加劇細胞凋亡速度，因此，研發一種新型牛病毒性腹瀉和牛傳染性鼻氣管炎(Bovine viral diarrhea and bovine rhinotracheitis，BVDV-IBRV)二聯苗非常重要[7-8]。

傳統貼壁細胞規模化培養病毒主要采用轉瓶、細胞工廠或者微載體細胞培養方法，但是轉瓶和細胞工廠存在工藝復雜、容易污染、批間差大、生產成本高、效率低下等諸多問題[9]，微載體技術雖然提高了單位面積的細胞密度，但是也存在逐級放大困難、生產成本高等局限性[10]。所以能夠馴化出1株全懸浮培養牛腎細胞(Madin-Darby bovine kidney cell,MDBK)，在反應器中實現規模化培養BVDV和IBRV，不僅解決上述傳統工藝中的諸多技術難題，而且能夠節約成本、提高細胞飼養密度和病毒滴度，通過反應器逐級放大的工藝技術，實現病毒抗原生產的自動化，而且該技術也是目前規模化疫苗生產領域的前沿技術[11-12]。

本試驗旨在馴化1株全懸浮無血清培養MDBK細胞株，在此基礎上，采用反應器逐級放大模式生產BVDV和IBRV，制備BVDV-IBRV二聯滅活苗，并通過免疫不同年齡階段的黑白花奶牛，檢測血清中BVDV和IBRV中和抗體效價，評價疫苗的免疫效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與種毒 MDBK細胞、BVDV(NMG株)和IBRV(LY株)，均購自金宇保靈生物藥品有限公司。

1.1.2 主要試劑 新生牛血清(NBS)，購自金源康生物科技有限公司；DMEM干粉培養基和胰酶，均購自Gibco公司；低血清和無血清CD干粉培養基，均購自建順生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器設備 B2-生物安全柜，香港力申發展有限公司產品；IC1000自動細胞計數儀，Countstar公司產品；二氧化碳恒溫培養箱，Thermo公司產品；ISF1-XC恒溫振蕩培養箱，德國阿道夫科耐公司產品；XDS-1B倒置顯微鏡，卡薩帝公司產品；DASGIP四聯平行反應器(5 L)，Eppendorf(德國)公司產品；60 L和500 L生物反應器，均為北京清大天一科技有限公司產品。

1.2 MDBK低血清全懸浮細胞馴化

1.2.1 MDBK貼壁細胞降血清馴化 取對數生長期的MDBK貼壁細胞，按照常規方法連續傳代，并將正常的MDBK貼壁細胞培養基(含10%新生牛血清的DMEM培養基)逐步按照低血清培養液(含3% 新生牛血清的CD培養基)含量占30%、50%和80%進行替換，期間觀察細胞的生長情況，待細胞適應該密度后，才能再次提高低血清培養液的含量，直至最終全部替換為低血清培養液，并且保證細胞能連續穩定傳代。

1.2.2 MDBK低血清細胞懸浮馴化 將1.2.1中馴化的貼壁細胞，經胰酶消化為單細胞懸液，用低血清培養液調整細胞密度為1×106個/mL，于37 ℃、5%CO2恒溫搖床100～110 r/min培養，培養過程中會有細胞死亡，需要將1.2.1中馴化的細胞再次富集，直到懸浮細胞能夠連續穩定傳代，該細胞株即為MDBK低血清懸浮細胞。

1.2.3 MDBK無血清細胞懸浮馴化 將1.2.2中的細胞1 000 r/min 離心5 min，棄上清，按照1.2.1中方法對低血清懸浮細胞進行無血清懸浮培養，替換培養期間保證細胞能連續穩定傳代，最終全部替換為無血清CD培養基，然后將細胞懸液通過70 μm濾膜截留細胞團塊，繼續培養，反復過濾培養，直到細胞結團緩解后再更換為40 μm濾膜，重復上述步驟，直至得到MDBK無血清全懸浮培養細胞株。

1.3 MDBK無血清懸浮株初始接種密度的確定 將1.2.3中獲得的MDBK無血清懸浮細胞株離心，使用無血清CD培養基調整細胞密度為0.25×106、0.50×106、0.75×106個/mL 和1.00×106個/mL，置于37 ℃、5% CO2恒溫搖床，100～110 r/min培養，每天記錄細胞數量和細胞活力，直到細胞活力顯著下降，確定細胞初始接種密度。

1.4 MDBK無血清全懸浮細胞連續傳代 將1.2.3中獲得的MDBK無血清懸浮細胞株離心后，使用無血清CD培養基調整初始密度為1.3中確定的密度，置于37 ℃、5%CO2恒溫搖床，100～110 r/min培養48 h后，連續傳代，每次傳代初始密度均相同，記錄細胞數量和細胞活力。

1.5 MDBK擴大培養與BVDV和IBRV的產毒

1.5.1 MDBK細胞逐級放大培養 將MDBK無血清懸浮細胞株用無血清CD培養基調整細胞密度為1.0×106個/mL，共8 L懸液，分別打入2個5 L反應器中，調節培養條件為溫度37 ℃，溶氧40%～60%，pH 7.0～7.2，轉速40～60 r/min，每天取樣觀察細胞數量和細胞活力，待細胞密度為8.0×106～8.2×106個/mL，活力為95%以上時，將培養細胞逐級放大于60～500 L反應器中。

1.5.2 BVDV和IBRV的接毒 (1)MDBK懸浮細胞接毒：取培養好的懸浮細胞加入到60 L反應器中，調整細胞密度為2×106個/mL，終體積為50 L，按照1%濃度分別接入BVDV和IBRV病毒液，培養條件同1.5.1，按照相同的方法將細胞擴大培養到500 L，接入BVDV和IBRV病毒液，取培養液加入4%的臺盼藍染色，觀察并計算細胞活力，待細胞活力下降到60%～70%后，收獲病毒液。(2)MDBK貼壁細胞接毒：將培養48 h的長成單層的MDBK細胞棄掉培養液后，更換含有2%新生牛血清的DMEM培養基，分別按照1.5%和2.0%的濃度分別接入BVDV和IBRV病毒液，待細胞病變達到80%以上時收獲病毒液。

1.5.3 MDBK貼壁細胞和懸浮細胞培養BVDV和IBRV病毒滴度的測定 將收獲的所有病毒樣品用無血清DMEM培養基進行10倍梯度(1×10-1～1×10-7)稀釋，將1×10-4～1×10-7稀釋度的樣品按0.1 mL/孔加入96孔板中，每個濃度做8個重復，同時設置對照組，即只加無血清DMEM培養基。將上述加入液體的孔均同步鋪入MDBK貼壁細胞懸液0.1 mL，細胞密度為2×106個/mL，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養并觀察，記錄有細胞病變的孔，按照Reed-Muench方法[13]計算BVDV和IBRV病毒滴度。

1.6 BVDV和IBRV二聯苗免疫攻毒保護 將反應器收獲的BVDV和IBRV病毒液制備成二聯苗，按照2.00、1.00、0.50 mL/頭和0.25 mL/頭共4個劑量免疫健康易感牛，每個劑量組各頸部肌內免疫10頭牛，一免后21 d以相同劑量進行二免，間隔14 d采血后攻毒，設置10頭牛作為攻毒對照組(BVDV和IBRV分別攻毒，各攻5頭)，攻毒使用BVDV的病毒含量為3.00 lgTCID50/mL，IBRV的病毒含量為7.50 lgTCID50/mL，每種病毒分別按照10 mL滴鼻，攻毒結束后連續觀察14 d，每日測定體溫并采集鼻拭子檢測排毒情況，按照1.6.1和1.6.2中BVD和IBR發病標準、評價動物發病情況。

1.6.1 BVD發病判定標準 體溫升高到40 ℃以上，持續至少2 d；取攻毒后8～10 d的鼻拭子進行PCR檢測，至少1 d的鼻拭子呈現BVDV核酸陽性，滿足以上情況判定為發病；否則判定為未發病。

1.6.2 IBR發病判定標準 體溫升高到40 ℃以上，持續至少2 d；取攻毒后8～10 d的鼻拭子進行PCR檢測，至少1 d的鼻拭子呈現IBRV核酸陽性，滿足以上情況判定為發病；否則判定為未發病。

1.7 BVDV和IBRV二聯苗臨床免疫效果評價 將反應器收獲的BVDV和IBRV病毒液制備成二聯苗，選擇不同日齡階段的牛只，包括犢牛(1～6月齡)、后備母牛(6～24月齡)和成年母牛(24月齡以上)各30頭，分別作為犢牛免疫組、后備母牛免疫組和成年母牛免疫組，將以上各組動物首次免疫，每頭牛2 mL，首免21 d后進行二免，間隔14 d后采集血清，另外隨機選擇不同日齡內未免疫牛，共采集30頭牛血清作為空白對照組，根據參考文獻[14]檢測上述血清的BVDV和IBRV中和抗體效價。

1.8 統計分析 試驗結果以“平均值±標準差”方式表示。采用 SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析，使用方差分析法進行差異顯著性檢驗。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 MDBK低血清全懸浮細胞馴化 MDBK貼壁細胞由血清濃度為10%逐步降低為3%，再通過含3%血清的CD培養基馴化為1株能夠穩定傳代的低血清MDBK懸浮株，細胞狀態如圖1A所示，說明該細胞適應了低血清CD培養基，雖然結團率比較高，但是細胞生長速度較快，細胞狀態較好。為了獲得MDBK無血清懸浮株，由低血清培養液逐步替換為無血清懸浮培養液，再通過層層過濾篩選出了結團率低并能穩定傳代的MDBK無血清懸浮株，其對數期細胞狀態如圖1B所示，該細胞株為分散的單個細胞，形態近似圓形、大小均一，胞質均勻透明，細胞邊界明顯，結團率明顯降低。

圖1 MDBK細胞逐步降血清馴化過程中細胞生長情況

2.2 MDBK無血清懸浮株初始接種密度的確定 MDBK無血清懸浮細胞4種起始密度相關的生長曲線如圖2所示，若初始接種密度為0.25×106個/mL，細胞無法快速進入對數生長期，影響后期細胞生長速度；若初始接種密度為0.50×106個/mL和0.75×106個/mL，細胞均能正常進入對數期，而且細胞活力保持在90%并且可維持144 h以上；若起始接種密度為1.00×106個/mL，細胞培養至4 d后活力開始大幅下降，所以綜合考慮，細胞最適接種密度在0.50×106～0.75×106個/mL,不得低于0.50×106個/mL。

圖2 MDBK細胞連續培養細胞活力和細胞密度

2.3 MDBK無血清全懸浮細胞連續傳代 在MDBK無血清懸浮細胞接種密度為0.50×106個/mL基礎上，培養2 d后傳代，并連續傳代10代以上，培養過程中細胞密度和活力如圖3所示，呈現非常規律的細胞密度曲線，細胞活力維持在較高水平，并且每次傳代后，細胞都能很快恢復生長速度，說明該MDBK無血清細胞懸浮株在初始密度為0.50×106個/mL時能夠穩定連續傳代。

圖3 MDBK連續傳代細胞密度和細胞活力

在連續放大培養過程中，細胞大小均一、形態近圓形、細胞透亮、狀態良好，如圖4所示，反應器中的細胞生長狀態要好于搖瓶，主要由于反應器對于O2、CO2濃度和pH控制精度較高，能為細胞提供非常穩定的培養環境。

圖4 MDBK細胞擴大培養前后細胞狀態對比

2.4 MDBK擴大培養與BVDV和IBRV的產毒

2.4.1 MDBK擴大培養及BVDV和IBRV接毒 將狀態良好的500 L MDBK懸浮細胞分別接種1% 的IBRV和BVDV病毒，培養3 d和5 d后，于顯微鏡下觀察細胞狀態，如圖5所示，可以看出細胞界限模糊，透光度下降，臺盼藍染色后，死亡細胞增多，細胞活力明顯下降，下降原因是病毒在細胞中大量增殖，造成細胞病變甚至死亡，說明這2種病毒能夠侵染MDBK懸浮細胞。

圖5 MDBK細胞擴大培養接毒后細胞狀態

2.4.2 MDBK貼壁細胞和懸浮細胞培養BVDV和IBRV病毒滴度的測定 向貼壁MDBK細胞、60 L MDBK懸浮細胞以及擴大培養的500 L MDBK懸浮細胞分別接種BVDV和IBRV，測定收獲病毒液的病毒滴度，結果如表1所示，60 L懸浮細胞產毒量幾乎與貼壁細胞相同，而500 L擴大培養的病毒含量略微下降，主要原因可能是擴大細胞培養規模時，反應器控制精密度下降導致細胞活力略微下降。綜上所述，MDBK懸浮細胞可以適應BVDV和IBRV病毒增殖。

表1 BVDV和IBRV在MDBK貼壁和懸浮細胞病毒滴度

2.5 BVDV和IBRV二聯苗免疫攻毒保護 結果如表2所示，攻毒對照組中牛只BVDV和IBRV抗體水平均低于1∶2，攻毒后每頭牛均出現了IBR和BVD的癥狀，發病率達100%，說明分別使用病毒含量為3.00 lgTCID50/mL BVDV和7.50 lgTCID50/mL IBRV的活病毒液10 mL感染牛能致其個體發病。免疫劑量為1.00 mL/頭組中，BVDV攻毒結果顯示僅有1頭牛發病，4頭牛未發病，免疫保護率為80%；IBRV攻毒結果顯示，5頭牛均未發病，免疫保護率為100%。所有免疫攻毒牛中和抗體結果顯示，BVDV中和抗體效價≥1∶128的共有13頭，攻毒后均未發病，免疫保護率為100%；IBRV中和抗體效價≥1∶64的共有14頭，攻毒后均未發病，免疫保護率為100%，說明BVDV和IBRV二聯苗攻毒保護和中和抗體滴度存在線性關系，臨床可以應用抗體水平檢測評價疫苗的免疫效果。

表2 BVDV和IBRV血清學與免疫攻毒保護的相關性

2.6 BVDV-IBRV 二聯苗臨床免疫效果評價 免疫組牛群二免后14 d，對不同年齡段的牛采集血清，并對樣本中BVDV和IBRV中和抗體進行檢測，中和抗體效價的平均值如表3所示，后備母牛免疫組和成年母牛免疫組IBRV中和抗體效價高于空白對照組，差異極顯著(P<0.01)，犢牛免疫組IBRV抗體效價顯著高于空白對照組(P<0.05)；各免疫組中BVDV中和抗體效價均極顯著高于空白對照組(P<0.01)，所以由BVDV-IBRV二聯苗行業標準確定BVDV和IBRV中和抗體效價均能夠達到免疫保護效果，IBRV免疫保護效果與奶牛的日齡有關，日齡較小的奶牛其免疫保護效果較差；而BVDV免疫保護效果與奶牛日齡關系不大。

表3 二免后奶牛群BVDV和IBRV的中和抗體效價

3 討論

通過懸浮培養工藝制備抗原是未來生產獸用滅活疫苗主要的工藝流程，也是能夠制備出優質、高滴度病毒抗原的主要工藝手段。但是，目前尚未找到1株能夠適應BVDV和IBRV增殖的敏感懸浮細胞[15-16]，故本試驗通過貼壁-貼壁降血清-懸浮降血清-懸浮無血清3個過程[14]，將對病毒敏感的MDBK貼壁細胞逐步適應無血清懸浮培養環境，最終獲得了1株MDBK無血清懸浮細胞株，該細胞株生長速度非常快，在細胞密度為0.50×106個/mL的基礎上，MDBK細胞傳代時間為48 h，而且在漫長馴化過程中依舊沒有改變細胞對BVDV和IBRV敏感的遺傳特性，該細胞為大規模生產BVDV和IBRV提供了有利條件，實現抗原生產自動化，也對防控牛群中BVDV和IBRV隱形感染具有非常重大的意義。

MDBK懸浮株在由搖瓶逐級放大到500 L反應器過程中，生長穩定。按照1%的接毒劑量接入病毒后，能夠穩定收獲病毒液，但病毒收獲時間需要摸索，收獲太早病毒產生量未達到峰值，太晚病毒外殼會裂解、病毒失活，可以通過檢測不同時間段病毒滴度，確認收獲時間和收獲時細胞活力[12]。另外，細胞狀態好壞也與病毒滴度呈正相關，由于反應器自動化調節精度高，所以通過反應器制備抗原滴度明顯比搖瓶高5～10倍[17]。另外懸浮培養的病毒滴度與傳統貼壁工藝差距不大，而且反應器具有操作工藝簡單、批間差異小、生產成本低、生產效率高、污染概率低等優點，所以反應器規模化制備病毒抗原可以替代傳統貼壁工藝，也是未來疫苗工藝的重要發展趨勢[18]。

綜合BVDV-IBRV二聯滅活疫苗的血清學和攻毒保護試驗結果分析顯示，對80%牛起到保護作用的BVDV中和抗體效價應不低于1∶128，對80%的牛起到保護作用的IBRV抗體效價應不低于1∶64，所以牛群BVDV和IBRV中和抗體分別≥1∶128和≥1∶64就可以保證免疫后動物能夠有效地抵抗強毒攻擊，這也可以為今后免疫持續期研究及疫苗免疫效果評價提供重要的數據參考。另外，相關研究也表明，高滴度的BVDV中和抗體能夠起到有效保護效果[19]。但是不同年齡段奶牛在接種BVDV-IBRV二聯滅活苗后，BVDV中和抗體效價水平一致，均達到較高的抗體滴度，對于IBRV抗體效價，犢牛抗體水平為1∶68，明顯低于后備母牛和成年母牛，但也可以起到有一定的免疫保護作用，為了保證犢牛免疫保護效果，需要犢牛群多次接種以提高中和抗體效價。

本試驗制備的BVDV-IBRV二聯滅活疫苗能夠有效防控我國BVD和IBR的傳播和流行，為更好促進養牛業健康和快速發展提供了有力的技術支持。