致羔羊腹瀉沙門菌的分離鑒定及耐藥性檢測

劉蒙恩，劉 洋，左春生

(1.河南省葉縣中等專業學校，河南 葉縣 467200；2.新鄉醫學院口腔醫學院，河南 新鄉 453003 ；3.信陽農林學院動物科技學院，河南 信陽 464000)

沙門菌是臨床主要的食物源病原菌之一，該菌具有廣泛的宿主性，可以感染多種動物及人，引起動物和人發病的沙門菌的血清型目前有2 523個，該菌感染主要引起多種動物的敗血癥、腸胃炎和流產等，其感染率和死亡率均較高[1-3]。沙門菌可以在運輸中的動物和未煮熟的動物食品間傳播，對人的危害也較大，已成為公共衛生研究的熱點問題[4-5]。羊沙門菌病主要由鼠傷寒沙門菌、都柏林沙門菌、羊流產沙門菌等不同血清型的沙門菌引起。沙門菌可以感染不同階段、不同品種的羊，其中斷奶或斷奶不久的羊較新生羔羊易感，且以血性下痢為主要臨床癥狀，其死亡率可達60%以上[6-7]。因此，養殖場應注重該病的防治。目前，臨床中應用抗生素是控制沙門菌感染的主要手段之一，但隨著抗生素的濫用，沙門菌的耐藥現象也日趨嚴重，且產生多重耐藥菌菌株，對該菌的防控帶來一定的困難，同時可導致肉產品中的藥物殘留，危害人類的身體健康[8-11]。因此，對沙門菌的合理防控具有重要的公共衛生學意義。

本試驗于2018—2020年采集信陽地區不同養殖場中患腹瀉羔羊的肛拭子、糞便等病料組織274份，進行沙門菌的分離鑒定，并檢測分離菌株的致病性、耐藥表型和耐藥基因的攜帶情況，以期為該地區養殖場中致羔羊腹瀉沙門菌的綜合防控提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2018—2020年采集自河南省信陽地區不同養殖場中患腹瀉羔羊的肛拭子、糞便等病料組織274份。

1.2 主要試劑 沙門菌增菌液(TTB)、沙門菌顯色鑒定培養基、營養肉湯，均購自廣東環凱微生物科技有限公司；32E腸桿科菌生化鑒定試紙條，購自法國生物梅里埃公司；藥敏紙片，購自北京天壇藥物生物技術開發公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、DL2 000 Marker、2×TaqMaster Mix，均購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3 實驗動物 675只昆明系小鼠，體重約22 g，由信陽農林學院動物科技學院實驗動物中心飼養。

1.4 細菌分離培養與初步鑒定 將采集的樣品進行處理后接種于TTB，37 ℃震蕩培養8～12 h，增菌后接種于沙門菌顯色鑒定培養基，37 ℃恒溫培養12～18 h后，挑單菌落純化培養，革蘭染色顯微鏡下觀察其形態學特征。取純化的分離菌株，按照說明書調整濃度進行生化鑒定試驗。

1.5 細菌PCR鑒定 參照參考文獻[12]，根據GenBank中沙門菌基因序列，設計沙門菌保守區引物invA(5′-ACAGTGCTCGTTTACGACCTGAAT-3′；5′-AGACGACTGGTACTGATCGATAAT-3′),引物擴增片段大小為244 bp，引物由深圳華大基因股份有限公司合成。采用細菌基因組DNA試劑盒制備DNA模板，進行PCR鑒定。回收PCR產物送華大基因測序，其測序結果與GenBank中登錄的沙門菌參考株進行同源性比對鑒定。

1.6 致病性試驗 將分離菌株培養至對數期，菌落計數，每株分離菌株灌胃攻毒組5只小鼠，劑量為0.25 mL(107CFU/mL)，對照組灌胃等量的無菌肉湯，觀察6 d，記錄小鼠的發病和死亡情況。

1.7 藥敏試驗 藥敏試驗參照美國臨床實驗室標準委員會(CLSI)2019年推薦的標準K-B紙片法進行操作和判斷耐藥(R)、敏感(S)或中介(I)，分析分離菌株的耐藥性。

1.8 耐藥基因的檢測 參照參考文獻[13]，根據GenBank中登錄的沙門菌耐藥基因序列：β-內酰胺類耐藥基因(tem、cmy、shv)，磺胺類耐藥基因(sul1、sul2、sul3)，氨基糖苷類耐藥基因[aac(3)-Iv、aac(6′)-Ib]，喹諾酮類耐藥基因[gyr(A)、gyr(B)、qur(S)]，四環素類耐藥基因[tet(A)、tet(M)、tet(R)]，酰胺醇類耐藥基因[flo(R)]，多肽類耐藥基因(mcr-1)，用Primer 5.0設計引物，并由華大基因合成引物，對上述7類耐藥基因進行PCR擴增檢測。

2 結果

2.1 細菌分離培養與初步鑒定 在沙門菌顯色培養基上長出邊緣整齊、大小一致、藍紫色的菌落，染色鏡檢可見無莢膜、兩端鈍圓的陰性短桿菌，通過生化試驗初步鑒定為沙門菌，共有134株。

2.2 細菌PCR鑒定 對初步鑒定的134株沙門菌，用沙門菌特異性引物invA進行PCR鑒定，結果顯示，134株沙門菌均擴增出大約為244 bp的目的條帶(圖1)，且134株分離菌的測序結果與GenBank中登錄的沙門菌參考株同源性均在97.9%以上，從分子生物水平說明分離菌株為沙門菌。

圖1 細菌PCR鑒定

2.3 致病性試驗 攻毒組的小鼠出現精神沉郁、采食量減少、寒顫，個別出現腹瀉，有的未表現出臨床癥狀即出現急性死亡，對照組小鼠至試驗結束未出現發病和死亡情況。從發病死亡的小鼠體內分離得到沙門菌，經統計102株沙門菌能引起小鼠發病。

2.4 耐藥性分析 抗生素敏感性試驗結果如表1所示，分離的102株沙門菌對氨芐西林、慶大霉素、新霉素、大觀霉素、多西環素、土霉素、多黏菌素、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺噁唑啉、磺胺間甲氧嘧啶10種藥物的耐藥性比較嚴重，耐藥率在70.6%～100%。對頭孢噻肟、頭孢噻呋、恩諾沙星、氟苯尼考、氧氟沙星、環丙沙星6種藥物的耐藥率較低，耐藥率在8.8%～31.3%。說明該地分離的沙門菌耐藥性嚴重。如表2所示，臨床中分離的102株沙門菌呈現多重耐藥性，耐16、6種藥物各有6株，耐 15、14、9種藥物各有7株，耐7種藥物有5株，耐12、11、10種藥物分離菌株最多，分別占分離菌株的15.7%、16.7%和14.7%。

表1 耐藥性檢測結果

表2 多重耐藥性檢測結果

2.5 耐藥基因檢測 分離的沙門菌對7類藥物的16種耐藥基因的PCR檢測結果見表3，分離的102株沙門菌共攜帶16種耐藥基因；其中耐藥基因sul1、sul2、sul3、aac(3)-Iv、aac(6′)-Ib、tet(A)、tet(M)、tet(R)、mcr-1檢出率為61.4%～100%；耐藥基因tem、cmy、shv、gyr(A)、gyr(B)、qur(S)、flo(R)檢出率為4.9%～20.6%。說明分離的沙門菌攜帶多種耐藥基因。

表3 耐藥基因檢測結果

3 討論

沙門菌具有多種血清型，可以感染多種動物和人類，并且該菌傳播途徑較廣泛，易引發食物中毒和敗血癥等，成為臨床重要的人獸共患病病原之一[14-15]。隨著肉羊養殖數量的增加，關于羊的沙門菌病報道逐漸增多，且對羔羊危害較嚴重。許多研究表明，沙門菌具有多種血清型且發病具有地區性，給疫苗研制帶來一定困難，也是導致其廣泛流行的重要因素之一[9-11]。因此，相關部門應該重視沙門菌病的綜合防控。本試驗于2018—2020年采集信陽地區不同養殖場中患腹瀉羔羊的肛拭子、糞便等病料組織274份，從中分離得到102株致病性沙門菌，說明該區的養殖場中致羔羊腹瀉沙門菌感染嚴重，存在一定的潛在威脅，應該注意該病的綜合防控。

國內許多研究表明，從豬場、雞場分離的沙門菌具有很強的耐藥性，呈現多重耐藥性[16-17]。國內關于致羔羊腹瀉沙門菌耐藥性的報道較少。本試驗表明，分離的102株沙門菌對常用的抗生素產生了很強的耐藥性，對氨芐西林、慶大霉素、新霉素等10種藥物的耐藥率介于70.6%～100.0%，對其他藥物的耐藥率介于8.8%～31.3%。說明沙門菌耐藥性是普遍存在的，在臨床中應該注意抗生素的合理使用。研究表明，沙門菌耐藥性的產生與抗生素的使用有關，還與攜帶的耐藥基因有關，耐藥基因可以通過多種途徑在動物和人類之間傳播，對人類健康造成隱患[18-19]。本試驗結果表明，分離的102株沙門菌共攜帶16種耐藥基因，尤其對磺胺類和四環素類耐藥基因檢出率較高，攜帶耐藥基因型是否是引起耐藥性的主要因素，有待進一步研究。本試驗結果為該地區的致羔羊腹瀉沙門菌的綜合防控提供了數據支持。