中老年人2 型糖尿病遺傳風(fēng)險與腦灰質(zhì)體積的關(guān)聯(lián)研究

趙秋月，杜鑫，張揚，張權(quán)

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，天津 300052）

隨著年齡的增長，腦結(jié)構(gòu)和功能會發(fā)生逐漸衰退[1]，島葉、海馬及扣帶回等多個腦區(qū)的體積隨著老齡化而減小[2]。除了年齡因素外，腦老化還與性別[3]、教育[4]、環(huán)境[5]及遺傳[6]等因素有關(guān)。2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種好發(fā)于中老年人的慢性代謝性疾病，研究表明，T2DM 可加速腦老化，造成多個腦區(qū)的灰質(zhì)體積下降[7]。T2DM 受遺傳因素的影響，但T2DM 遺傳風(fēng)險與腦老化的關(guān)系尚不明確。本研究通過構(gòu)建T2DM 遺傳風(fēng)險評分，旨在探究非糖尿病的中老年人T2DM 遺傳風(fēng)險與腦灰質(zhì)體積（Gray matter volume，GMV）的關(guān)系。考慮到腦老化的典型行為學(xué)改變是記憶功能下降[8]，本研究采用中介分析方法進一步分析T2DM 遺傳風(fēng)險是否通過調(diào)控GMV 進而影響記憶功能。

1 資料與方法

1.1 研究對象

招募中老年志愿者116例，其中男54例，女62例，年齡45～74歲，平均（57.3±7.9）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)包括：①年齡≥45歲；②能夠完成磁共振圖像采集以及認(rèn)知功能測評；③無精神及神經(jīng)疾病；④無癡呆家族史；⑤無酒精依賴史；⑥磁共振掃描未發(fā)現(xiàn)腦器質(zhì)性病變；⑦無糖尿病；⑧右利手；⑨簡易智力狀態(tài)檢查量表（Mini-mental state examination，MMSE）評分≥27 分。本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有志愿者均簽署知情同意書，自愿參加實驗。

1.2 研究方法

1.2.1 一般認(rèn)知及記憶測評

運用MMSE 量表評估受試者的一般認(rèn)知功能；采用數(shù)字2-back[9]實驗評估受試者的工作記憶；采用聽覺詞語學(xué)習(xí)測驗量表（Auditory verbal learning test，AVLT）[10]評估受試者的詞語情景記憶功能，包括短時記憶及長時記憶。

1.2.2 遺傳學(xué)數(shù)據(jù)采集及處理

采集靜脈血10 mL 用于基因分型檢測。使用適用于亞洲人的基因分型芯片（Asian screening array，ASA）對70 萬個單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）位點進行基因分型。使用PLINK1.9 軟件包對遺傳數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，SNP 水平排除標(biāo)準(zhǔn)包括：①最小等位基因頻率（Minor allele frequency，MAF）<0.05；②基因型缺失率>0.01；③不符合哈迪溫伯平衡，P<1×10-6。受試者水平排除標(biāo)準(zhǔn)包括：①SNP 缺失率>0.02；②雜合率超過3 倍標(biāo)準(zhǔn)差；③基因分型檢測的性別和自述性別不匹配；④受試者間有親屬關(guān)系（Identity by state>0.1875），保留一位受試者。以千人基因組階段3 數(shù)據(jù)作為參考模板，利用IMPUTE2[11]進行基因型插補。插補后取info>0.8，以去除質(zhì)量較差的位點。經(jīng)過質(zhì)控和插補，最終獲得9 044 671 個SNPs，納入115 例受試者（1例受試者因SNPs 缺失率>0.02 而被排除）。

1.2.3 計算遺傳風(fēng)險評分

基于東亞人（包括77 418 個T2DM 患者和356 122 個正常對照）的T2DM 全基因組關(guān)聯(lián)性研究（Genome-wide association studies，GWAS）確定了111 個T2DM 風(fēng)險位點（P<5×10-8）[12]，本研究的遺傳數(shù)據(jù)包含其中的97 個位點。考慮到不同的計算方法可能會影響累積遺傳效應(yīng)結(jié)果，因此本研究分別使用三種不同的方法計算每個受試者97 個位點的累積遺傳效應(yīng)，即遺傳風(fēng)險評分（Genetic risk score，GRS），以相互驗證結(jié)果的可靠性。以下三個公式中的Gi 表示第i 個遺傳風(fēng)險位點的風(fēng)險等位基因數(shù)量。

①簡單相加遺傳風(fēng)險評分（Simple count genetic risk score，SC-GRS）：為所有SNPs 的風(fēng)險等位基因數(shù)量和[13]，公式如下：

②OR 值加權(quán)的遺傳風(fēng)險評分（Odds ratio weighted genetic risk score，OR-GRS）：以SNP 對T2DM 的效應(yīng)量作為權(quán)重，計算所有SNPs 的OR 值權(quán)重和[14]，為了保證結(jié)果的可靠性，本文用于計算OR-GRS 的OR 值使用的是上述T2DM GWAS 研究所獲得的每個位點的OR值，并且將對數(shù)轉(zhuǎn)換后的OR 值作為每個SNP 的權(quán)重納入到OR-GRS 的計算中，公式如下：

③可釋方差加權(quán)的遺傳風(fēng)險評分（Explained variance weighted genetic risk score，EV-GRS）：將SNPs 權(quán)重和MAF 納入到遺傳風(fēng)險評分的計算中[15]，公式如下：

其中，MAF 來源于公共數(shù)據(jù)庫，美國國家生物技術(shù)信息中心（National center for biotechnology information，NCBI）[16]中的東亞人群。

1.2.4 磁共振圖像采集

采用GE Discovery MR750 3.0T 磁共振掃描設(shè)備及8 通道頭部相控陣線圈。采集3D-T1WI 高分辨率結(jié)構(gòu)像，掃描參數(shù)如下：重復(fù)時間/回波時間：8.2/3.2 ms，反轉(zhuǎn)時間450 ms，翻轉(zhuǎn)角12°，視野256 mm×256 mm,矩陣256×256，層厚1 mm，無間隔，體素大小1 mm×1 mm×1 mm，188 層矢狀位掃描。

1.2.5 圖像預(yù)處理

采用基于SPM12（http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm）中的CAT12（http://dbm.neuro.uni-jena.de/cat）工具包進行VBM 分析。通過以下預(yù)處理步驟獲得所有受試者的GMV 圖像：①將全腦分割成灰質(zhì)、白質(zhì)和腦脊液；②將分割后的圖像按照DARTEL 算法配準(zhǔn)到蒙特利爾神經(jīng)研究所（Montreal neurological institute，MNI）標(biāo)準(zhǔn)空間；③將體素重采樣為1.5 mm×1.5 mm×1.5 mm 大小；④對標(biāo)準(zhǔn)化后的圖像進行調(diào)整以獲得體積圖像；⑤檢查圖像質(zhì)量；⑥采用8 mm半高全寬（Full width at half maximum，F(xiàn)WHM）高斯核對所有圖像進行空間平滑。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 對人口統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)，認(rèn)知功能評分以及遺傳風(fēng)險評分進行統(tǒng)計描述。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）來表示符合正態(tài)分布的計量資料，以中位數(shù)（25 分位數(shù)，75 分位數(shù)），即M（P25，P75）表示非正態(tài)分布的計量資料，以數(shù)量（百分比）表示計數(shù)資料。將不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進行正態(tài)化轉(zhuǎn)換，使用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析。

采用SPM12 中的一般線性模型進行基于體素的GMV 與GRST2DM的關(guān)聯(lián)分析，將年齡、性別、教育年限和全腦體積作為協(xié)變量。使用基于DPABI 軟件包[17]的蒙特卡羅模擬算法進行多重比較校正（AlphaSim 校正），體素水平P<0.001，連續(xù)體素數(shù)分別大于355（SC-GRST2DM），343（OR-GRST2DM）和444（EV-GRST2DM）的腦區(qū)可達團塊水平P<0.05。以顯著關(guān)聯(lián)腦區(qū)中的最顯著相關(guān)點（Peak 點）為中心，建立半徑為6 mm 的ROI，提取ROI 內(nèi)的平均GMV值，進行基于ROI 的偏相關(guān)分析，在控制年齡、性別、教育年限和全腦體積的情況下，分析GRST2DM與GMV的相關(guān)性，以及GMV 與記憶表現(xiàn)之間的相關(guān)性，P<0.05 設(shè)定為相關(guān)性具有統(tǒng)計學(xué)意義。

采用SPSS 25.0 中的PROCESS（http://www.processmacro.org/index.html）插件進行中介效應(yīng)分析。將GRST2DM作為自變量（X），記憶評分作為因變量（Y），GMV 作為中介變量（M），模型中其他參數(shù)如下：模型4，5000 次bootstrap 抽樣，95%置信區(qū)間（Confidence interval，CI）。協(xié)變量包括性別、年齡、教育年限和全腦體積。當(dāng)統(tǒng)計結(jié)果顯示95%CI 不包括0 時認(rèn)為中介效應(yīng)顯著。

2 結(jié)果

2.1 研究對象

115 例中老年受試者的人口學(xué)，認(rèn)知功能評分及遺傳風(fēng)險評分見表1。

表1 人口統(tǒng)計學(xué)、認(rèn)知表現(xiàn)和遺傳風(fēng)險評分特征

2.2 GRST2DM 和GMV 的相關(guān)性分析

基于體素的分析發(fā)現(xiàn)，SC-GRST2DM、OR-GRST2DM及EV-GRST2DM均與右側(cè)枕葉（楔葉及距狀裂皮層）GMV 呈顯著負(fù)相關(guān)（AlphaSim 校正，P<0.05）；此外，SC-GRST2DM和左側(cè)尾狀核的GMV 顯著負(fù)相關(guān)（AlphaSim 校正，P<0.05），見圖1。具體解剖位置的MNI 坐標(biāo)、團塊大小及統(tǒng)計值見表2。

表2 GRST2DM 和GMV 相關(guān)的腦區(qū)

基于ROI 的相關(guān)性分析結(jié)果顯示三種GRST2DM均與右側(cè)枕葉（楔葉及距狀裂皮層）GMV 呈顯著負(fù)相關(guān)（SC-GRST2DM：r=-0.310，P=0.001；OR-GRST2DM：r=-0.331，P<0.001；EV-GRST2DM：r=-0.353，P<0.001），SC-GRST2DM和左側(cè)尾狀核的GMV 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.385，P<0.001），見圖1。

2.3 中介分析

偏相關(guān)分析結(jié)果顯示,與三種GRST2DM相關(guān)的右側(cè)枕葉（楔葉及距狀裂皮層）GMV均與2-back正確數(shù)呈正相關(guān)（SC-GRST2DM：r=0.253，P=0.008；OR-GRST2DM：r=0.242，P=0.012；EV-GRST2DM：r=0.242，P=0.012）（圖2），與其他記憶指標(biāo)無顯著相關(guān)性（P>0.05）。

中介分析結(jié)果顯示，右側(cè)枕葉GMV 對GRST2DM和2-back 正確數(shù)之間的關(guān)聯(lián)具有顯著中介效應(yīng)（SC-GRST2DM：效應(yīng)量=-0.0702，95%CI（-0.1473，-0.0103）；OR-GRST2DM：效應(yīng)量=-0.0627，95%CI（-0.1325，-0.0069）；EV-GRST2DM：效應(yīng)量=-0.0665，95%CI（-0.1365，-0.0094））（圖3）。

3 討論

本研究首次采用影像遺傳學(xué)方法探究中老年人T2DM 遺傳風(fēng)險與腦老化之間的關(guān)系。既往不同研究者采用不同的方法計算遺傳風(fēng)險評分，主要考慮最小等位基因數(shù)量、SNP 效應(yīng)量及可釋方差權(quán)重等因素，各種計算方法側(cè)重點不同，可能會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，本研究采用三種不同的遺傳風(fēng)險評分計算方法，相互驗證，以增加結(jié)果的可靠性。結(jié)果表明，利用三種評分方法均可發(fā)現(xiàn)中老年人T2DM 遺傳風(fēng)險評分與右側(cè)枕葉（楔葉及距狀裂皮層）GMV 呈負(fù)相關(guān)，并且T2DM 遺傳風(fēng)險可能通過調(diào)控右側(cè)枕葉的GMV，進而影響工作記憶表現(xiàn)。

既往研究證實，正常腦老化過程中可見枕葉萎縮，尤其是楔葉及距狀裂皮層區(qū)域的萎縮[18-19]，且T2DM 患者楔葉萎縮較正常對照組更為明顯[20]。本研究顯示，在控制了年齡、性別、教育程度及全腦體積后，非糖尿病的中老年人GRST2DM與右側(cè)枕葉（楔葉及距狀裂皮層）GMV 仍呈顯著負(fù)相關(guān)，即T2DM遺傳風(fēng)險評分越高者，其GMV 越小，提示T2DM 遺傳風(fēng)險可能是加速中老年人右側(cè)枕葉GMV 減小的因素之一。用于計算GRST2DM的多個遺傳位點所屬的基因與血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)（如HNF1A，F(xiàn)OXA2）及胰島素信號通路（INS）調(diào)節(jié)密切相關(guān)[21-22]，而血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)及胰島素信號通路與神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)。動物實驗研究表明，血糖波動可導(dǎo)致神經(jīng)炎癥，并引起神經(jīng)元凋亡[23]，而完整的胰島素信號通路能夠促進神經(jīng)元的存活以及突觸可塑性[24]。因此，T2DM遺傳風(fēng)險可能通過調(diào)控血糖代謝及胰島素信號通路，進而影響神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)及功能，加速腦老化。

本研究中，右側(cè)枕葉（楔葉及距狀裂皮層）GMV與2-back 任務(wù)表現(xiàn)呈正相關(guān)，即GMV 越大者，2-back 任務(wù)表現(xiàn)越好，提示楔葉及距狀裂皮層區(qū)域可能是工作記憶任務(wù)的神經(jīng)基礎(chǔ)之一。N-back 任務(wù)執(zhí)行過程中需要對記憶信息進行監(jiān)測、更新和處理，與工作記憶中的多個關(guān)鍵過程緊密相關(guān)[25]。Liu等[26]的研究發(fā)現(xiàn)楔葉GMV 和工作記憶任務(wù)表現(xiàn)呈正相關(guān)關(guān)系。Moon等[27]的研究也證明了楔葉及距狀裂皮層功能影響工作記憶表現(xiàn)。本研究結(jié)果與既往研究報道一致，進一步說明楔葉及距狀裂皮層與工作記憶間的緊密聯(lián)系。本研究中介分析發(fā)現(xiàn)，右側(cè)枕葉（楔葉及距狀裂皮層）GMV 介導(dǎo)了中老年人GRST2DM與2-back 任務(wù)表現(xiàn)之間的關(guān)聯(lián)，提示T2DM 遺傳風(fēng)險可能通過調(diào)控老年人的右側(cè)楔葉及距狀裂皮層GMV，進而影響其工作記憶功能。既往研究表明，與正常對照組相比，T2DM 患者工作記憶能力相對較差[28]。結(jié)合上述T2DM 遺傳風(fēng)險調(diào)控血糖及胰島素通路的生物學(xué)機制，本研究推測T2DM 遺傳風(fēng)險較高者，可能對神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及功能的影響更大，進而表現(xiàn)出工作記憶能力下降。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建遺傳-腦-認(rèn)知通路的方法，發(fā)現(xiàn)T2DM 遺傳風(fēng)險可調(diào)控中老年人的腦GMV，進而影響其工作記憶表現(xiàn)。本研究有助于加深對腦老化機制的理解。本研究的局限性在于為橫斷面研究，無法評估受試者GMV 的動態(tài)改變。在今后的工作中，通過縱向隨訪，分析T2DM 遺傳風(fēng)險對GMV 動態(tài)改變的影響，及其與行為學(xué)變化之間的關(guān)聯(lián)，將會進一步明確T2DM 遺傳風(fēng)險與腦老化之間的關(guān)系。此外，本研究所涉及到的相關(guān)性分析結(jié)果中，相關(guān)系數(shù)r 并不是很高，因此該相關(guān)性仍待后期更大樣本的驗證。