腦缺血再灌注損傷中鈣超載相關(guān)通路研究進展

李傳朋 高 穎,2 高永紅,2 蔣 萍 董興魯,2

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院腦病科，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)腦病研究院，北京 100700

中風(fēng)是目前造成患者致殘率和致死率較高的主要原因之一。我國中風(fēng)患病率為873.4/10 萬，死亡率為149.49/10 萬[1]。其主要類型為缺血性中風(fēng)，研究發(fā)現(xiàn)在缺血性中風(fēng)的病理過程中，即使血流恢復(fù)了，病情也并不能減輕，反而會進一步加重缺血半暗帶的損傷，這個病理過程稱之為“腦缺血再灌注損傷”，它是急性缺血性中風(fēng)的核心病理環(huán)節(jié)，也是目前研究的熱點問題[2]。在腦缺血再灌注中，缺血的組織在恢復(fù)血供后會使細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量明顯增加，從而引起細(xì)胞損傷的現(xiàn)象稱為鈣超載。研究顯示，細(xì)胞內(nèi)鈣超載是中風(fēng)后腦缺血再灌注損傷的關(guān)鍵病理因素[3]，同時也是許多有害因素導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的共同通路[4]，但鈣超載在腦缺血再灌注損傷的上下游病理機制仍需進一步梳理。因此，結(jié)合近年來國內(nèi)外對缺血性中風(fēng)腦缺血再灌注過程中鈣超載機制的研究進行綜述，以進一步闡明鈣超載上下游的病理機制途徑，以期為研發(fā)抗鈣超載中風(fēng)治療的新藥提供參考。

1 介導(dǎo)鈣超載的機制

1.1 N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體與鈣超載

NMDA 受體是一種Ca2+雙重門控系統(tǒng)，大量分布在神經(jīng)元突觸后膜[5]。研究顯示，缺血性中風(fēng)后神經(jīng)系統(tǒng)的損傷與NMDA 受體密切相關(guān)[6]，谷氨酸受體過度激活引起的神經(jīng)元死亡是由細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高介導(dǎo)的。一方面，缺血性中風(fēng)發(fā)生后，去極化引起的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞大量釋放谷氨酸，這些谷氨酸大量聚集在神經(jīng)細(xì)胞突觸部位，與NMDA 受體結(jié)合，激活NMDA 受體，造成Ca2+通道打開，Ca2+大量涌入，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞鈣超載。有研究將嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞暴露于谷氨酸，觀察到細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量增加，使用藥物抑制谷氨酸的釋放可顯著降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量，減少細(xì)胞死亡，證實了谷氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的作用與Ca2+內(nèi)流有關(guān)[7]。Park 等[8]在研究槲皮素治療對谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷中海馬鈣蛋白表達的調(diào)節(jié)作用時，發(fā)現(xiàn)谷氨酸興奮毒性顯著增加海馬細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，而槲皮素可以減輕鈣超載。另一方面，NMDA 受體包括許多亞型，N-methyl-D-aspartate（NMDA）-R2A subunit（NR2A）與N-methyl-D-aspartate（NMDA）-R2B subunit（NR2B）是NMDA 受體介導(dǎo)Ca2+通道關(guān)閉與開放的兩個最主要的亞基，其中NR2B 是主要的磷酸化調(diào)控區(qū)域[9]。在缺血再灌注過程中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5（cyclin-dependent kinase-5，CDK5）可與NR2B 相互作用并使NR2B 磷酸化，即在NR2B 加入一個磷酸基團，進而影響NMDA 受體的活性，造成NMDA 受體通道的開放率增加，促進大量Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致鈣超載的發(fā)生[10]。Zhou 等[11]通過一種膜滲透性肽（Tat-CDK5-CTM）特異性破壞CDK5 和NR2B 的結(jié)合，然后通過溶酶體介導(dǎo)的途徑導(dǎo)致CDK5 降解。發(fā)現(xiàn)Tat-CDK5-CTM 的使用可以抑制氧和葡萄糖剝奪處理的神經(jīng)元中的鈣超載，結(jié)果表明CDK5 通過磷酸化NR2B 參與了鈣超載的發(fā)生。

1.2 瞬時受體電位通道2（transient receptor potential melastatin 2，TRPM2）與鈣超載

TRPM2 屬于瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP）通道家族的一員，是由細(xì)胞內(nèi)ADP-核糖（adenosine diphosphate ribose，ADPR）門控形成的非選擇性Ca2+通道[12]。TRPM2 通道是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)改變的關(guān)鍵機制，TRPM2 通道活性的異常在細(xì)胞凋亡中起重要作用，從而破壞各種細(xì)胞功能[13]。TRPM2蛋白由胞質(zhì)N 和C 末端調(diào)節(jié)域組成，N 末端包含4 個TRPM 通道家族同源成員和1 個位于殘基404～416的鈣調(diào)蛋白結(jié)合基序。TRPM2 在C 端跨膜結(jié)構(gòu)域具有TRP 區(qū)段，分為兩個區(qū)域：第二可變區(qū)和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。在TRPM2 的C 末端，盤繞的基序與特定的亞基相互作用，并將TRPM2 組裝成功能性四聚體形式。TRPM2 的C 末端還含有核苷二磷酸連接的X 型同源基序包括11 個殘基的ADPR 結(jié)合口袋。ADPR是一種調(diào)節(jié)Ca2+內(nèi)流的新型第二信使，并且可以直接打開TRPM2[14]。腦缺血再灌注發(fā)生后活性氧（reactive oxygen species，ROS）的升高導(dǎo)致poly-ADPR 聚合酶、poly-ADPR 糖水解酶和DNA 損傷。然后，poly-ADPR聚合酶和poly-ADPR 糖水解酶將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉(zhuǎn)化為ADPR 單體以激活TRPM2，促進Ca2+內(nèi)流，進而導(dǎo)致鈣超載的發(fā)生。有研究通過降低TRPM2的表達，觀察到細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的降低，并且降低了雄性小鼠海馬神經(jīng)元的損傷，證實了TRPM2 在介導(dǎo)Ca2+的作用[15]。同時，通過敲低TRPM2，培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡明顯減少。表明TRPM2 促進缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡，而通過使用靶向TRPM2 的RNA 抑制劑TRPM2 siRNA 處理顯著抑制了細(xì)胞Ca2+流入和神經(jīng)元細(xì)胞死亡[16]。

1.3 酸敏感離子通道（acid sensitive ion channels，ASICs）與鈣超載

ASICs 屬于表皮鈉通道的一種，它是H+門控型陽離子通道，在細(xì)胞外H+濃度增高時被激活開放[17]。ASICs 包含六種亞基，其中一個亞基ASIC1a 在大腦中廣泛表達，對酸離子十分敏感，是導(dǎo)致酸中毒的主要因素，當(dāng)受到酸離子刺激時，其對Ca2+保持較高的通透性，觸發(fā)Ca2+超載，進而導(dǎo)致缺血性損傷后神經(jīng)元損傷的加重[18]。缺血性中風(fēng)發(fā)生后，血流阻斷和ATP 耗竭引起厭氧糖酵解的代償反應(yīng)，以提供短暫的能量支持，但導(dǎo)致了乳酸和H+濃度增加[19]。當(dāng)進行無氧的糖酵解時，腦缺血缺氧極易激活對酸的敏感性，打開對ASIC1a 鈣通透的同聚體通道引起細(xì)胞外鈣內(nèi)流[20]。同時，ASIC1a 膜受體和離子通道的激活也受到pH 值的影響，在腦缺血再灌注期間，氧供應(yīng)不足致使腦組織進行無氧的糖酵解，產(chǎn)物乳酸和ATP水解產(chǎn)物的積聚致缺血性組織周圍的pH 值顯著下降，嚴(yán)重腦缺血時可導(dǎo)致缺血區(qū)組織周圍的pH 值明顯降到6.0，缺血缺氧組織酸化時，ASIC1a通道開放，大量Ca2+內(nèi)流，進而導(dǎo)致鈣超載[21]。此外，Ca2+成像技術(shù)也顯示酸中毒可通過ASIC1a 誘導(dǎo)Ca2+進入，并且以谷氨酸受體非依賴性方式促進細(xì)胞質(zhì)Ca2+升高。在培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中，ASIC1a 激活及其介導(dǎo)的Ca2+進入?yún)⑴c酸中毒誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，而ASICs 阻滯劑的應(yīng)用可顯著降低這種損傷[22]。

1.4 ATP 供應(yīng)不足影響鈉/鈣交換器（Na+/Ca2+exchanger，NCX）介導(dǎo)鈣超載

ATP 供應(yīng)充足是細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的重要條件，而血流通暢又為維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)提供了重要保障。當(dāng)缺血性中風(fēng)發(fā)生后，血流的減少導(dǎo)致ATP 的產(chǎn)生大量減少，細(xì)胞膜電勢能減弱，造成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞去極化，激活Ca2+通道，引發(fā)了細(xì)胞內(nèi)的鈣超載[23]。在這個過程中，NCX 扮演著重要的角色。NCX 是一種雙向離子交換轉(zhuǎn)換器，在生理情況下，它可利用Na+的濃度梯度泵入3 個Na+排除1 個Ca2+。而當(dāng)能量產(chǎn)生發(fā)生障礙時，NCX 的能量供應(yīng)受到影響，排除Na+的工作停止，細(xì)胞內(nèi)Na+濃度升高。NCX 工作方式發(fā)生轉(zhuǎn)向，即變成泵出3 個Na+泵入1 個Ca2+。前一種生理情況下稱之為“前向模式”，后一種稱之為“反向模式”[24]。NCX 有三種亞型，分別為NCX1、NCX2、NCX3，NCX1在誘導(dǎo)腦缺血/再灌注過程中引起鈣超載起重要作用。基于使用NCX 抑制劑的實驗發(fā)現(xiàn)，NCX 反向模式是體內(nèi)腦缺血-再灌注過程中出現(xiàn)鈣超載的重要誘因[25]。研究表明，當(dāng)ATP 水平足夠時，激活NCX1的前向模式，NCX1 將Na+泵入細(xì)胞并從細(xì)胞內(nèi)泵出Ca2+。而在缺血性再灌注過程中，組織處于缺血缺氧狀態(tài)，ATP 的產(chǎn)生大量減少，激活了NCX1 的反向模式，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載的發(fā)生[26]。另一項研究表明，NCX 可增加鈉瞬變，鈉流入驅(qū)動NCX 逆轉(zhuǎn)，引發(fā)大量二次鈣升高，同時促進鈉的輸出，導(dǎo)致離子梯度的破壞，并最終導(dǎo)致了鈣超載[27]。除此之外，通過內(nèi)源性鈣蛋白酶抑制劑的慢病毒遞送抑制NCX3 的切割可以阻止與神經(jīng)元死亡相關(guān)的繼發(fā)性鈣超載。通過表達功能性NCX2 也可阻止鈣超載的發(fā)生，從而證實了NCX 通過Ca2+的泵入?yún)⑴c鈣超載的發(fā)生[28]。

1.5 高爾基體Ca2+-ATPase（secretory pathway Ca2+-ATPase，SPCA）與鈣超載

SPCA 是定位于高爾基體上的Ca2+泵，分泌型SPCA參與高爾基體Ca2+的釋放和吸收，對腦缺血再灌注過程中鈣超載的發(fā)生發(fā)揮了重要作用。高爾基體膜泡中濃度的變化趨勢與細(xì)胞質(zhì)濃度變化趨勢正好相反。在缺血和再灌注早期高爾基體膜泡濃度下降迅速，而細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度迅速上升，高爾基體SPCA 通過泵出高爾基體儲存的Ca2+造成了細(xì)胞內(nèi)的鈣超載[29]。Li 等[30]以4 只血管閉塞大鼠為模型，檢測大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)和高爾基體囊泡中SPCA1 的表達和Ca2+濃度的研究表明，高爾基體小泡中Ca2+含量的變化與缺血和再灌注過程中的Ca2+濃度相反。在缺血和早期再灌注過程中，高爾基體小泡急劇下降表明高爾基體參與了建立過程通過唯一的鈣通道肌醇1，4，5-三磷酸受體途徑使細(xì)胞質(zhì)發(fā)生鈣超載。而再灌注后期，高爾基體囊泡中的Ca2+濃度迅速恢復(fù)，顯示高爾基體可以“緩解”鈣超載的情況。研究表明高爾基體應(yīng)激對腦缺血和再灌注反應(yīng)可通過重塑細(xì)胞質(zhì)Ca2+的穩(wěn)態(tài)來實現(xiàn)。

1.6 鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）介導(dǎo)鈣超載

CaM 是一種多功能的中間信使蛋白，它通過結(jié)合Ca2+來轉(zhuǎn)換鈣信號[31]。研究顯示，在大鼠腦缺血再灌注損傷模型中，缺血再灌注組腦內(nèi)CaM 活性水平升高[32]。CaM 可通過影響L-型Ca2+電壓門控鈣通道的開放，調(diào)節(jié)興奮-收縮偶聯(lián)中Ca2+進入細(xì)胞的過程，進而介導(dǎo)鈣超載的發(fā)生，引起破壞性腦功能障礙[33]。Yuan 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，血漿CaM 水平與急性缺血性卒中引起的神經(jīng)功能缺損的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，發(fā)現(xiàn)CaM 通過介導(dǎo)L-型Ca2+電壓門控鈣通道的開放信號，促進鈣內(nèi)流引起了鈣超載。

2 鈣超載介導(dǎo)損傷的機制

2.1 導(dǎo)致神經(jīng)元線粒體裂變和線粒體損傷

缺血性中風(fēng)可導(dǎo)致線粒體功能障礙。在這個過程中，鈣超載神經(jīng)元的胞質(zhì)Ca2+升高造成大量Ca2+進入線粒體，超過線粒體所能承受的鈣閾值，導(dǎo)致線粒體鈣超載，進而造成線粒體損傷、線粒體通透性轉(zhuǎn)換以及促凋亡蛋白的釋放[35]。在中風(fēng)后幾小時內(nèi)一些恢復(fù)刺激前Ca2+水平的神經(jīng)元細(xì)胞依然會在之后的時間出現(xiàn)死亡跡象，這種延遲死亡現(xiàn)象是由鈣超載致線粒體損傷造成的，受損的線粒體啟動細(xì)胞凋亡樣死亡信號，引發(fā)了延遲性細(xì)胞死亡[36]。Pivovarova 等[37]為了研究線粒體鈣超載與細(xì)胞脆弱性之間的聯(lián)系，檢驗只有鈣超載損傷的線粒體亞群釋放凋亡因子的假設(shè)，測量了單個線粒體中總Ca2+的濃度，發(fā)現(xiàn)延遲死亡的神經(jīng)元是由于鈣超載導(dǎo)致線粒體亞群釋放凋亡因子，而其他未受損的線粒體維持正常功能。Hu 等[38]研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷期間線粒體的變化涉及缺血性再灌注誘導(dǎo)線粒體的過度活化，線粒體功能障礙和延遲的神經(jīng)元死亡。這是由于細(xì)胞內(nèi)鈣超載刺激了線粒體通透性轉(zhuǎn)換的持續(xù)開放，導(dǎo)致線粒體損傷。

2.2 導(dǎo)致氧化應(yīng)激

鈣超載激活Ca2+依賴性分解代謝酶，作為第二信使觸發(fā)下游信號途徑的級聯(lián)事件，伴隨著Ca2+依賴性酶的激活，這些酶上調(diào)ROS 的生成，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，抑制呼吸鏈酶的活性，并促進ROS 介導(dǎo)的信號調(diào)節(jié)[39]。鈣超載也會導(dǎo)致氧化還原調(diào)節(jié)的多聚蛋白復(fù)合物的開放，促進凋亡蛋白的釋放，從而引發(fā)死亡級聯(lián)反應(yīng)。在這些過程中，由過量ROS 產(chǎn)生引起的氧化應(yīng)激在腦損傷中起主要作用[40]。Ca2+流入產(chǎn)生的ROS 包括超氧陰離子自由基、過氧化氫、羥基自由基、一氧化氮和過氧亞硝酸鹽，由于ROS 的產(chǎn)生，加劇了氧化應(yīng)激反應(yīng)[41]。在缺血早期鈣流入啟動下游炎癥和凋亡介質(zhì)，發(fā)生解耦并產(chǎn)生許多ROS，導(dǎo)致了廣泛的氧化應(yīng)激。ROS 樣自由基通過細(xì)胞器膜過氧化破壞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器破壞，誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡[42]。

2.3 激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)參與分泌蛋白及膜蛋白正確折疊與分泌的重要細(xì)胞器，內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是實現(xiàn)其功能的基本條件[43]。雖然內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有極強的內(nèi)穩(wěn)態(tài)體系，但在急性缺血性中風(fēng)發(fā)病過程中，病灶區(qū)域腦組織因血供不足處于缺血缺氧狀態(tài)。此時病灶組織中自由基含量明顯增加，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ca2+泵功能，從而逐步耗竭內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2+，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，鈣超載可通過鈣依賴性蛋白酶引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，刺激細(xì)胞凋亡。在這個過程中，鈣蛋白酶通過靶向鈣調(diào)節(jié)蛋白導(dǎo)致鈣從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的長期耗竭會損害蛋白質(zhì)的加工[44]。導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊的蛋白質(zhì)會明顯增多，當(dāng)超出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理能力時，細(xì)胞會激活相關(guān)信號級聯(lián)反應(yīng)，啟動未折疊蛋白反應(yīng)來應(yīng)對條件的變化和恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)良好的蛋白質(zhì)折疊環(huán)境，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[45]。但隨著刺激的持續(xù)存在，會激活由其介導(dǎo)的凋亡通路，發(fā)生細(xì)胞凋亡。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能嚴(yán)重受損時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲存的持續(xù)受損再攝取又會加劇細(xì)胞內(nèi)鈣超載，促進μ-鈣蛋白酶的自溶。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和鈣超載之間就形成了惡性循環(huán)[46]。

3 討論

腦血管疾病是目前危害人類健康的疾病之一，在以缺血性中風(fēng)為代表的腦血管疾病中，腦缺血再灌注損傷占據(jù)著核心病理環(huán)節(jié)的位置。而鈣超載是缺血性再灌注損傷許多通路的共同環(huán)節(jié)，基于鈣超載的病理網(wǎng)絡(luò)尋找干預(yù)途徑具有十分重要的科學(xué)意義。在鈣超載的上游網(wǎng)絡(luò)中，目前的研究主要集中在谷氨酸興奮毒性、TRPM2、NCX、ASICs，然而在高爾基體、CaM 致鈣超載的過程還有待深入研究。在下游，鈣超載可通過氧化應(yīng)激、線粒體損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可見細(xì)胞凋亡是再灌注損傷許多通路的終末結(jié)果，如何在細(xì)胞啟動程序化死亡之前，針對上下游的各條網(wǎng)絡(luò)通路進行干預(yù)，進而大范圍降低細(xì)胞凋亡的數(shù)量從而減輕缺血性再灌注損傷，是今后一個時期缺血性中風(fēng)臨床干預(yù)的一個重要研究方向。因此，基于鈣超載上下游的網(wǎng)狀機制來探索尋找抗腦血管病干預(yù)機制具有廣闊的前景和重要的意義，為缺血性中風(fēng)新藥研發(fā)提供了重要的方向。