包載攜氧微球的天然多糖自愈合水凝膠制備及性能研究

＊姚雪亮 袁偉忠

（同濟大學材料科學與工程學院高分子材料系 上海 201804）

隨著組織工程領域載細胞水凝膠的不斷應用，研究人員發現水凝膠載體中缺乏氧氣的環境，會導致所包載的種子細胞因為局部氧分壓的不足，無法支撐其存活，從而影響治療效果。因此，如何解決載細胞組織工程材料局部缺氧情況成為了目前亟待解決的問題[1]。

如圖1所示，本研究中，利用京尼平對明膠的交聯作用，通過反相乳液聚合的方法，制備包裹了全氟己烷（PFH）乳液的明膠攜氧微球。同時利用OSA與CMCS之間的席夫堿反應，制備封裝了攜氧微球的自愈合水凝膠載體。對其力學強度、自愈合性能、微觀形貌以及攜氧釋放能力等進行探究，探討該水凝膠系統作為攜氧載體的可靠性和應用前景。

圖1 載攜氧微球自愈合水凝膠示意圖

1.試驗部分

(1)試驗試劑

全氟己烷（PFH），明膠、液體石蠟、Span 80、京尼平、石油醚、異丙醇、無水乙醇、海藻酸鈉、高碘酸鈉、乙二醇、羧甲基殼聚糖，分析純、上海國藥集團；蛋黃卵磷脂，分析純，Adamas公司。氧化海藻酸鈉（OSA）根據文獻方法[2]制備獲得。并根據文獻方法[3]用鹽酸羥胺氧化滴定的方法對OSA的氧化度進行測定，測得氧化度為24.76%。

(2)試驗儀器

分析天平（FA2004），舜宇恒平公司；恒溫磁力油浴鍋（85-2C，帶攪拌），鄭州長城實驗裝備公司；冷凍干燥機（FA-2A），細胞粉碎機（BILON-950E），比朗儀器公司；流變儀（HAAKE MARS 40），德國哈克公司；掃描電子顯微鏡（Quanta 200 FEG），美國FEI公司；紅外光譜儀（Nicolet5700），美國熱電公司。

(3)具備攜氧能力的明膠微球的制備

在60ml液體石蠟中加入6ml Span 80，攪拌至穩定。在60ml 5%的明膠水溶液中加入1ml 10% PFH乳液，混合均勻后投入到液體石蠟中，80℃下攪拌2h，冷卻至室溫后加入2ml 10%的京尼平水溶液，攪拌6h，得到明膠微球懸浮液。懸浮液使用離心機在1000rpm離心5min，棄上清液后分別用石油醚、異丙醇和乙醇洗滌3次。得到攜氧明膠微球的乙醇分散液。使用前在分散液中持續鼓吹高純氧氣4h后，用細胞濾網將微球濾出，用去離子水洗滌2次。

(4)載攜氧微球自愈合水凝膠的制備

以PBS為溶劑，配置質量分數為4%的CMCS溶液，配置質量分數為5%和10%的OSA溶液，分別按體積比1:1混合，加入一定量處理過的攜氧微球，室溫下緩慢攪拌，靜置脫泡，得到載攜氧微球的CMCS/OSA水凝膠。

2.結果與討論

(1)載攜氧微球自愈合水凝膠制備結果討論

如圖2所示明膠與明膠微球的紅外光譜，可以發現相較于明膠，明膠微球在3434cm-1附近的寬峰向低波數方向發生了位移，屬于明膠酰胺基的O-H或N-H的拉伸振動特征吸收峰，這證明由N-H基團參與形成了一定數量的氫鍵，可見京尼平通過與明膠中的氨基發生席夫堿反應，形成氫鍵后得到了明膠微球。

圖2 制備所得微球及凝膠的紅外譜圖

如圖2所示SA與OSA的紅外光譜，可以發現相較于SA，OSA在1732cm-1處出現了一個新的吸收峰，這里屬于醛羰基的對稱振動吸收峰，證明SA發生了氧化反應，生成了醛基。

如圖2所示，CMCS、OSA、及CMCS/OSA凝膠的紅外譜圖，相較于CMCS和OSA，CMCS/OSA水凝膠在1640cm-1處產生了一個新的吸收峰，這是CMCS中的氨基與OSA中的醛基之間發生了席夫堿反應，產生-N=C-伸縮振動峰，證明了交聯反應的發生。

(2)載攜氧微球自愈合水凝膠的流變性能的研究

對不同配比的CMCS/OSA水凝膠進行動態應變掃描，探究OSA濃度對其強度的影響。如圖3所示，CMCS/OSA水凝膠在低應變時始終保持了一定強度，當應變達到100%左右后，水凝膠結構被破壞，力學強度迅速下降。而相較于使用5% OSA的水凝膠，使用10% OSA的水凝膠的G’更高，具備了更好的力學強度。

圖3 不同配比CMCS/OSA水凝膠動態應變掃描（a）、動態時間掃描（b）

對不同配比的CMCS/OSA水凝膠進行動態時間掃描，以探究OSA濃度對其凝膠速度的影響。如圖3所示，CMCS/OSA水凝膠溶液在一定時間內強度逐漸上升，并在一定時間后G’超過G”，完成從溶膠向凝膠的相轉變。而隨著OSA的濃度增加，其凝膠速度也有所提高。通過圖3可知，使用5% OSA的水凝膠需要約7400s完成相轉變，而使用10% OSA的水凝膠僅需要約1400s即完成相轉變過程，且具備更高的力學強度。

(3)載攜氧微球自愈合水凝膠的自愈合性能研究

如圖4所示，通過將試樣切分后交換拼接，靜置一段時間后兩組樣品之間的邊界逐漸模糊，藍色水凝膠逐漸滲入透明水凝膠，用手提起后兩部分未發生分離，基本融為一體。

圖4 CMCS/OSA水凝膠自愈合性能宏觀實驗(a)及流變實驗(b)

利用流變儀對不同配比的CMCS/OSA水凝膠進行變換應變強度的動態時間掃描，以探究OSA濃度對其自愈合性能的影響。如圖4所示不同配比的CMCS/OSA水凝膠均能在1%低應變時保持較好的力學強度，當應變增大至500%時，水凝膠被破壞，強度迅速下降，而當應變恢復至1%后，凝膠能迅速完成自愈合，恢復到一定的力學強度。OSA的濃度對凝膠的自愈合性能沒有明顯的影響，但凝膠本身的強度會隨著OSA濃度的增加而提高。

(4)載攜氧微球自愈合水凝膠的可注射性能研究

用安裝有22G針頭的注射器吸取CMCS/OSA水凝膠，并連續注射擠出，如圖5所示，該水凝膠具備良好的可注射性。注射過程中可以保持凝膠態，對內部包載的細胞起到良好的保護作用。

圖5 CMCS/OSA水凝膠可注射性宏觀實驗(a)及流變測試(b)

利用流變儀對CMCS/OSA水凝膠進行穩態剪切掃描，以探究其可注射性。如圖5所示，該水凝膠隨著剪切速率的增加，粘度迅速下降，具有良好的可注射性。

(5)明膠微球的微觀形貌研究

利用SEM觀察明膠微球的微觀結構。如圖6所示，所制備的明膠微球呈較為規整的球形結構，粒徑1～10μm不等。較廣的粒徑分布有助于攜氧微球實現較長時間的氧氣釋放。

圖6 凍干明膠微球掃描電鏡圖

(6)載攜氧微球自愈合水凝膠的微觀結構研究

如圖7所示，CMCS/OSA水凝膠凍干后通過SEM觀察，有明顯的孔洞結構，且其孔徑分布在200μm左右，有足夠的空間用于封裝細胞以及攜氧微球。

圖7 凍干CMCS/OSA水凝膠掃描電鏡圖

如圖8所示，載攜氧微球自愈合水凝膠凍干后通過SEM觀察，其孔洞內壁分布有部分規整的球形結構，可見明膠攜氧微球較好的分布在該凝膠內部。

(7)載攜氧微球自愈合水凝膠的氧氣釋放性能研究

對PFH、攜氧微球及載攜氧微球自愈合水凝膠在一定時間內氧氣的釋放速率進行探究，如圖9所示，PFH乳液在投入無氧水中后，釋放速率極快，不足100s時即基本完成了釋放；攜氧明膠微球則保持了一定的釋放速率，約400s后完成釋放；載攜氧微球自愈合水凝膠則保持了最緩慢的釋放速率，約1200s后完成釋放。由此可見，明膠微球和載攜氧微球自愈合水凝膠均有利于實際應用中氧氣的緩釋。

(8)載攜氧微球自愈合水凝膠的細胞相容性研究

用不同含量、不同浸提時長的水凝膠及其組分的浸提液作為細胞培養基，與NIH 3T3細胞共同培養后，如圖10，圖11所示，隨著浸提液濃度的提高以及共孵育時間的增長，細胞存活率均呈現一定程度的提高，同時對比圖10和圖11可知，浸提時長對實驗結果的影響并不明顯。由此可知攜氧明膠微球、CMCS/OSA水凝膠以及載攜氧微球自愈合水凝膠均無細胞毒性。

圖10 不同濃度的24h浸提液與NIH 3T3細胞共培養（a）24h、（b）48h、（c）72h后細胞相對生長速率；（d）100%濃度24h浸提液與NIH 3T3共培養不同時間的相對生長速率

圖11 不同濃度的48h浸提液與NIH 3T3細胞共培養（a）24h、（b）48h、（c）72h后細胞相對生長速率；（d）100%濃度48h浸提液與NIH 3T3共培養不同時間的相對生長速率

3.結論

（1）通過反相乳液聚合的方法，利用京尼平對明膠的交聯效應制備了包裹PHF乳液的明膠攜氧微球。同時利用OSA與CMCS之間的席夫堿反應，得到具有自愈合性的攜氧微球水凝膠載體。通過研究發現，所得明膠攜氧微球粒徑分布合理，適宜作為攜氧材料緩釋封裝的載體使用。所得水凝膠具備良好的力學強度、自愈合性以及可注射性，內部孔徑分布合理，適宜用于攜氧微球的載體。對載攜氧微球自愈合水凝膠的氧氣緩釋性能進行了測試，相較于PFH的直接使用，攜氧微球和載攜氧微球自愈合水凝膠都做到了不同程度的緩釋功效。

（2）載攜氧微球自愈合水凝膠，具備良好的可注射性能，可以實現氧氣的緩釋功效，實現了攜氧材料的合理封裝、遞送和緩釋功能。在生物醫學領域具有潛在的研究和應用前景。