RNAi在作物病蟲害防治中的應用現狀綜述

謝鋒華 農知旺 吳 娟 郭珍珍 竺錫武

（湖南人文科技學院農業與生物技術學院，湖南婁底 417000）

植物病蟲害嚴重威脅作物的生長，影響作物的產量和品質。雖然噴施化學農藥能有效減輕病蟲害對作物的危害，但長期大量使用化學農藥易使其產生抗性，也會對環境造成污染。隨著生物技術的快速發展，基因改良在作物抗病蟲害中的應用越來越多。RNAi具有特異性、高效性、高穩定性、可遺傳性和可傳遞性等優點[1]，對病蟲害防治具有重大意義。

1 RNAi的概念及原理

1.1 RNAi概述

RNAi即 RNA 干擾（RNA interference），是指在進化過程中高度保守的、由mRNA同源互補序列的雙鏈RNA（dsRNA）介導的、mRNA高效特異性降解的基因沉默現象[2-3]。RNAi是近年來在基因功能研究中的重要發現，發生在除原核細胞以外的所有真核生物細胞內，具有重要的生物學功能[4-5]。RNAi發生過程主要有3個階段：第一階段，dsRNA被細胞內的核酸內切酶Dicer切割成21～23 bp的具有特定結構的小分子雙鏈 RNA（small interfering RNA，siRNA）[6]；第二階段，siRNA在解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，再由反義siRNA在核酸內切酶、核酸外切酶及解旋酶的輔助下識別同源序列蛋白，與siRNA結合形成siRNA誘導沉默復合物（siRNA-induced interference complex，RISC），RISC 會 與 靶 mRNA 識別并將其降解[7-9]；第三階段，siRNA反義鏈可以作為引物與靶mRNA結合，在依賴于RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）的催化下形成新的dsRNA[10]，新合成的dsRNA又可以被Dicer剪切形成大量新的siRNA，這樣不斷進行隨機降解性聚合酶鏈式反應（random degradative PCR），使細胞中的siRNA分子不斷增多，RNAi的作用被進一步放大，最終將靶mRNA完全降解[11-12]。

1.2 病毒誘導的基因沉默

病毒誘導的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）是以RNA干擾為基礎，主要用于研究動植物基因功能的一種遺傳技術。它是通過插入目的基因片段的重組病毒載體侵染植物后，沉默植物或動物的內源基因，使其功能表型出現變化，根據表型變化來研究基因功能，其屬于轉錄后基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）。 VIGS 是植物防御RNA病毒侵染的自然機制，可以阻止病毒在植物細胞中的增殖與擴散，在阻止病毒入侵的同時，也會抑制與植物內源基因同源片段的表達，屬于一種PTGS的類RNAi現象，普遍存在于植物體中[13-15]。

1.3 寄主誘導的基因沉默

寄主誘導的基因沉默（host induced gene silencing，HIGS）是以RNA干擾為基礎，對VIGS的進一步發展。在病害防治中，以病原真菌生長發育和侵染過程中的關鍵基因為靶基因，通過靶標基因的RNA干擾載體在寄主植物中表達，沉默病原真菌中的靶標基因，抑制病原真菌的生長與入侵，從而提高寄主植物的抗病性[16-18]。在蟲害防治中，主要以害蟲生長發育或重要行為過程中的關鍵基因為靶基因，通過靶標基因的小干擾RNA抑制目的基因的翻譯或轉錄，沉默靶標信使RNA，使害蟲的正常生長發育受到阻礙，從而提高寄主植物抗蟲的能力[19-20]。

2 RNAi在植物病害防治中的應用

植物病毒種類多、危害嚴重，感染病毒的作物產量和品質大幅度下降。利用RNA干擾技術可以特異性降解植物中病毒的靶基因，使病毒基因沉默，從而防治植物病害。

在小麥病害防治上，楊鵬[21]以赤霉菌基因（Chs7-3，Chs7-4，Gls-6 和 Myo II-14）為靶基因，經農桿菌介導轉入小麥，得到的轉基因植株增強了小麥對赤霉病的抗性。Panwar等[22]等通過根癌農桿菌的介導，沉默了小麥銹菌編碼的親環蛋白（PtCYC1）、MAP激酶（PtMAPK1）、鈣調磷酸酶 B（PtCNB）基因，沉默后抑制了菌絲的生長和真菌孢子的產生，明顯減輕小麥銹病的發生。BSMV-HIGS體系[23]成功沉默了小麥銹菌中的多個致病基因，如分泌蛋白基因Pst8713、蛋白激酶（Ps SRPKL）[24]、MADX 轉錄子（PstMCM1-1）[25]、小的 GTP 結合蛋白（PsRan）等，沉默后會抑制菌絲的生長與擴散，從而減輕小麥銹病的發生。

在水稻病害防治上，許趙蒙[26]對OsSBR1過表達水稻株系和基因編輯純合突變株系進行離體葉片接種鑒定，根據病斑面積大小，OsSBR1過表達株系表現出紋枯病感病，而基因編輯株系表現出抗病，從而驗證了OsSBR1對紋枯病抗性的負調控。唐 喆等[27]利用對稻瘟病菌分生孢子萌發有重要作用的RHO1基因為靶基因構建RNAi干擾載體，將其導入日本晴水稻品種中，得到了抗稻瘟病菌的轉基因水稻。Zhu等[28]通過雀麥花葉病毒誘導的RNA干擾，以MoMAC1、MoABC1和MoPMK1等3個致病基因為靶基因，將其接種到水稻上，能夠顯著提高水稻對稻瘟病菌的抗性。趙玉丹等[29]以EIL6基因為靶標基因構建RNAi干擾載體pRTV-nHA-OsEIL6，將其導入水稻品種泰粳394中，發現該轉基因水稻降低了對稻瘟病的抗性。Ahmed等[30]以水稻黑條矮縮病毒的致病關鍵基因P7-2和P8為靶標基因導入水稻后，發現轉基因水稻對病毒有較強的抗性。

在其他作物病害防治上，Xu等[31]在棉花中表達靶向棉花黃萎病病菌G蛋白信號轉導調節因子（Vd-RGS1）的RNA干擾載體，增強了棉花對黃萎病的抗性。Ghag等[32]通過內含子發夾RNA（ihpRNA）介導的真菌基因為靶基因構建小干擾RNA（ihpRNA-VEL和ihpRNA-FTF1），利用農桿菌介導轉入香蕉，得到的轉基因香蕉株系能夠抑制枯萎菌絲的生長，從而提高了香蕉植株對枯萎病的抗性。Zhang等[33]利用參與植物細胞分化、增殖、衰老和死亡的DEKs基因為靶基因構建RNAi干擾載體，沉默后發現番茄對灰霉病菌和假單胞菌的抗病性降低。Noman[34]等利用MYB轉錄因子CaPHL8基因為靶基因，將其轉入辣椒后發現接種青枯病病菌植株的CaPHL8表達上調，使辣椒降低了對青枯病的抗病性。

3 RNAi在害蟲防治中的應用

RNAi抗蟲技術利用RNAi技術沉默在害蟲生長發育或重要行為過程中的關鍵基因，阻礙害蟲正常的生長和繁殖，導致害蟲死亡，從而降低害蟲的危害程度。

大多數研究通過RNAi技術抑制害蟲生長發育來防治害蟲，孫李曈[35]以脫落酸合成的一種關鍵基因9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因（OsNCED3）為靶基因，發現過表達OsNCED3基因的水稻上褐飛虱的數量最低，且水稻植株平均受害級別顯著低于對照，使稻飛虱的生長發育受阻，說明過表達OsNCED3基因的水稻對褐飛虱具有一定的抗性。將以棉鈴蟲幾丁質酶基因（HaCHI）為靶基因的dsRNA轉入煙草中，沉默了棉鈴蟲的幾丁質酶基因，使棉鈴蟲幼蟲發育畸形，從而抑制棉鈴蟲的生長[36]。梁思佳[37]以影響中黑盲蝽生殖能力的As FAR基因為靶標，將其轉入棉花，當中黑盲蝽取食該轉基因棉花后，發現中黑盲蝽的生長發育受到了影響，說明該轉基因棉花對中黑盲蝽有較強的抗性。Gurusamy等[38]利用Cellfectin Ⅱ轉染試劑構建的RNAi干擾載體，將其飼喂草地貪夜蛾幼蟲，發現iap基因顯著下調，導致幼蟲的生長發育受到影響，從而抑制害蟲草地貪夜蛾的生長。Shivakumara等[39]利用msp-18和msp-20基因為靶基因，得到表達msp-18和msp-20的轉基因茄子，在轉基因茄子中南方根瘤菌的增殖分別減少了43.64%～69.68%和41.74%～67.30%，在生長發育的線蟲中，南方根瘤菌細胞壁修飾酶（CWMEs）與先鋒基因有著相互作用，先鋒基因msp-18和msp-20通過影響入侵線蟲CWME基因的穩態轉錄水平來提高茄子的抗線蟲性。

還有些研究是利用RNAi技術降低害蟲對化學農藥的抗性來防治害蟲。常 蕾等[40]利用Q型煙粉虱的一個P450基因（CYP6CM1）和一個羧酸酯酶基因（Coe1）為靶基因構建雙價RNAi載體，通過農桿菌介導轉入煙草，采用轉基因煙草喂養煙粉虱，發現煙粉虱CYP6CM1基因和Coe1基因的表達顯著降低，從而降低了煙粉虱對有機磷類殺蟲劑辛硫磷和煙堿類殺蟲劑阿維·吡蟲啉的抗藥性，顯著提高了殺蟲劑的防治效果。范繼巧等[41]利用蘋果黃蚜的P450基因AcCYP6CY14為靶基因構建RNAi載體，沉默了蘋果黃蚜的P450基因AcCYP6CY14，沉默后極顯著提高了蘋果黃蚜對吡蟲啉的敏感性，蘋果黃蚜的死亡率提高了65.2%，從而提高了殺蟲劑的防治效果。

4 存在的問題及展望

RNAi技術作為新型綠色環保的病蟲害防治技術，有著良好的應用前景，特別是在動植物基因功能的發掘與鑒定中發揮著重要作用。但是，RNAi技術的應用也存在一些問題。首先，RNAi能夠特異性地降低或抑制靶基因表達，但靶基因的沉默效率難以控制，且建立遺傳轉化體系需要很長時間，增加了科研周期[42]。同時，得到的轉基因植株在鑒定時會出現假陽性以及轉基因植物的安全性都是無法回避的問題。其次，RNAi如何實現大田應用，在大田使用RNAi防治病蟲害是否也會像化學農藥一樣使病蟲害對其產生抗性等問題都有待深入研究[43-44]。隨著科研的不斷攻關，越來越多的技術將會被發掘，而用RNAi聯合其他措施對病蟲害進行綜合防治將會成為一種趨勢[45]。相信隨著科學技術的不斷發展，RNAi的應用前景會越來越廣闊。