黑枸杞油脂肪酸和生育酚的分析

周琪樂(lè)，羅詩(shī)萌，高園，馮天威，方雪硯，崔東影，解慶剛

（1.北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所，北京 100069；2.北京市豐臺(tái)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京 100071；3.黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司，北京 100015）

黑枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）是茄科（Soicnaceae）枸杞屬（Lycium）多年生落葉植物的成熟果實(shí)[1-2]，與寧夏枸杞（Lycium barbarum）和黃枸杞（Lycium chinense）同屬我國(guó)原有的7種枸杞品種[3]。黑枸杞含有多種營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，如糖、氨基酸、精油、類胡蘿卜素、維生素、脂肪酸和礦物質(zhì)，以及類黃酮、多酚類和花青素等[4-6]，被用于治療各種疾病，包括心臟病、視力模糊、咳嗽、哮喘、糖尿病、腎衰竭、不育和神經(jīng)疲勞等[7-9]。黑枸杞具有保健功能且藥用價(jià)值高，再加上其風(fēng)味獨(dú)特，作為一種超級(jí)水果也越來(lái)越受歡迎[10-11]。隨著需求的日益增長(zhǎng)，黑枸杞在我國(guó)青海、新疆和甘肅等地區(qū)被廣泛種植。

近年來(lái)，由于人們對(duì)食用油的廣泛需求，開(kāi)發(fā)新資源食用油逐漸引起人們關(guān)注，從果蔬和茶葉等作物種子中提取的油脂可以作為替代植物油的候選[12-14]。枸杞油中含有豐富的不飽和脂肪酸、植物甾醇和生育酚等營(yíng)養(yǎng)成分[15]，與牛油果籽油、菠蘿蜜籽油、木瓜籽油、石榴籽油、南瓜籽油、茶葉籽油、葫蘆籽油、椰子油、牡丹籽油和橄欖油一樣具有降低血脂和膽固醇、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等心血管疾病的保健功能[16-17]，顯示出重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

枸杞果實(shí)中的種籽經(jīng)漂洗分離后可用于提取天然植物油脂。目前，枸杞油的提取方法主要有超臨界CO2流體萃取法、直接壓榨法、水代法和有機(jī)溶劑萃取法等[18]。將枸杞加工生產(chǎn)過(guò)程中分離出的副產(chǎn)品枸杞籽和果渣，采用超臨界CO2萃取技術(shù)萃取，可以得到純天然、高濃度及具備高效生理活性的枸杞油[19-21]。從枸杞中提取的籽油成分對(duì)人體有許多潛在的功效作用，人們也越來(lái)越關(guān)注枸杞的開(kāi)發(fā)。然而其在加工中產(chǎn)生的食品工業(yè)材料會(huì)造成環(huán)境污染，因此，將它們轉(zhuǎn)化為有價(jià)值的油脂，提高枸杞資源的利用效率，并減少殘留物，保證充分、高效發(fā)揮枸杞功效作用是必要的。黑枸杞和紅枸杞從果實(shí)形態(tài)、大小、顏色和植物化學(xué)成分等方面有明顯差別[1-3，9-10]。目前，對(duì)紅枸杞油加工工藝和化學(xué)成分的研究有較多報(bào)道[18-20]，但有關(guān)黑枸杞油的化學(xué)成分和生物活性的研究相對(duì)較少。

本研究旨在分析黑枸杞油中具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生物活性的脂肪酸和生育酚，并與不同加工方式得到的黑枸杞油、紅枸杞油和其它新資源植物油進(jìn)行比較。本研究對(duì)于不同產(chǎn)地和不同類型枸杞加工副產(chǎn)物的合理利用和推廣具有一定指導(dǎo)意義，也可為枸杞資源的持續(xù)和深度利用提供參考，對(duì)推動(dòng)枸杞產(chǎn)業(yè)鏈高質(zhì)量發(fā)展具有實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑枸杞油：青海晶珠藏藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)集團(tuán)。

鹽酸、氨水、乙醚、石油醚（沸程30℃～60℃）、乙醇（95%）、氯化鈉、硫酸氫鈉、氫氧化鉀（均為分析純）：北京化工廠有限責(zé)任公司；焦性沒(méi)食子酸（分析純）：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、無(wú)水硫酸鈉（分析純）：上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；正庚烷、異辛烷（色譜純）：天津光復(fù)精細(xì)化工有限公司；甲醇（色譜純）：德國(guó)EMD Millipore公司；三氟化硼甲醇溶液（濃度為15%）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；十一碳酸甘油三酯、混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品、單個(gè)脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品：北京中檢航標(biāo)計(jì)量技術(shù)有限公司；α-生育酚（＞99.0%）、β-生育酚（＞99.0%）、γ-生育酚（＞99.0%）和 δ-生育酚（＞99.0%）：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；其它試劑均為分析純；試驗(yàn)用水為超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm）。

Shimadzu GC-2010 Plus氣相色譜儀（配置氫火焰離子化檢測(cè)器）、SHIMAZSU UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；Hitachi L-2000型高效液相色譜儀（配置紫外檢測(cè)器）：日本日立公司；Sartorius CP225D電子分析天平：德國(guó)賽多利斯公司；METTlER TOLEDO ME204E/02分析天平：瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 脂肪酸的組成和含量分析

參照GB 5009.168—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪酸的測(cè)定》中的樣品處理方法對(duì)黑枸杞油中的脂肪酸進(jìn)行甲酯化并配制脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。向黑枸杞油試樣中加入內(nèi)標(biāo)物后進(jìn)行皂化和脂肪酸甲酯化反應(yīng)，反應(yīng)完成后經(jīng)極性毛細(xì)管柱氣相色譜分析，采用內(nèi)標(biāo)法定量測(cè)定脂肪酸甲酯含量。準(zhǔn)確稱取黑枸杞油0.5 g，再加入2.0 mL十一碳酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液、100 mg焦性沒(méi)食子酸、2 mL 95%乙醇和4 mL水，混勻。加入2%氫氧化鈉甲醇溶液8mL，在80℃水浴上回流，直至油滴消失。之后從冷凝器上端加入7 mL 15%三氟化硼甲醇溶液繼續(xù)回流2 min。之后迅速冷卻至室溫25℃，加入10 mL～30 mL正庚烷，振搖2 min，再加入飽和氯化鈉水溶液，靜置分層。吸取上層正庚烷提取溶液5 mL，加入3 g～5 g無(wú)水硫酸鈉，振搖、靜置，吸取上層溶液到進(jìn)樣瓶中待測(cè)定。

氣相色譜測(cè)定條件：SP2560毛細(xì)管色譜柱（100m×0.25 mm×0.2 μm）。進(jìn)樣器溫度270℃，檢測(cè)器溫度280℃，程序升溫條件為初始溫度100℃，持續(xù)13 min；100℃～180℃，升溫速率10℃/min，保持6 min；180℃～200℃，升溫速率1℃/min，保持20 min；200℃～230℃，升溫速率4℃/min，保持15.5 min。載氣為氮?dú)猓魉贋?.0 mL/min，分流比為 10 ∶1，進(jìn)樣體積：1.0 μL。

動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)（atherogenic index，AI）和易氧化性值（oxidisability value，Cox）分別參考 Ulbricht等[22]和Fatemi等[23]的方法進(jìn)行計(jì)算。AI值和Cox值的計(jì)算公式如下[24]。

式中：?jiǎn)尾伙柡椭舅幔╩onounsaturated fatty acids，MUFA）；多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）。

1.2.2 維生素E的組成和含量測(cè)定

參照GB 5009.82—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中維生素A、D、E的測(cè)定》中的樣品處理方法配制維生素E標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，并對(duì)黑枸杞油樣品中的維生素E進(jìn)行皂化、提取、凈化、濃縮后，經(jīng)反相液相色譜柱分離，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。稱取50 g黑枸杞油，加入30 mL無(wú)水乙醇、5 mL 10%抗壞血酸溶液、0.1 g 2，6-二叔丁基對(duì)甲基苯酚混勻，加入0.5%氫氧化鉀溶液10 mL，邊加邊振搖，混勻后于80℃恒溫水浴振蕩皂化30 min，結(jié)束后冷卻至室溫25℃。將皂化液轉(zhuǎn)至分液漏斗中并加入50 mL乙醚，振蕩萃取5 min，靜置分層后下層溶液加入50 mL混合醚液再次萃取，合并醚層。水洗醚層直至中性，去除水相。醚層經(jīng)無(wú)水硫酸鈉濾入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，于40℃水浴中減壓蒸餾至近干。用甲醇將蒸發(fā)瓶?jī)?nèi)殘留物溶解于5 mL容量瓶定容，溶液過(guò)0.22 μm有機(jī)系濾膜后，采用高效液相色譜測(cè)定。平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。

液相色譜條件：Security Guard ODS C18（10 μm，4 mm×3.0 mm）預(yù)柱，SHISEIDO CAPCELL PAK C18分析柱（5 μm，150 mm×4.6 mm），柱溫 38℃，流動(dòng)相為甲醇 ∶水（98∶2，體積比），流速 1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為300 nm，進(jìn)樣量 20 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS Statistics 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑枸杞油脂肪酸的組成和含量分析測(cè)定結(jié)果

脂肪酸組成和含量是確定油脂營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。黑枸杞油的脂肪酸組成和含量見(jiàn)表1。

表1 黑枸杞油的脂肪酸組成和含量Table 1 Fatty acid composition and lipid indices of Lycium ruthenicum Murr.seed oil

續(xù)表1 黑枸杞油的脂肪酸組成和含量Continue table 1 Fatty acid composition and lipid indices of Lycium ruthenicum Murr.seed oil

由表1可知，黑枸杞油共含有20種脂肪酸（fatty acids，F(xiàn)As），其中，SFA 和 UFA 10種，MUFA 和 PUFA 10 種，含量分別為 10.00、88.70、20.70、67.90 g/100 g。顯然，被作為加工副產(chǎn)品的黑枸杞種子和果皮中也含有高濃度的FAs。

MUFA 和 PUFA（C16：1n7+C17：1n7+C18：1n9c+C20：1+C24：1n9+C18：2n6c+C18：3n6+C18：3n3+C20：2+C20：5n3）、UFA 和 SFA（C14：0+C15：0+C16：0+C17：0+C18：0+C20：0+C21：0+C22：0+C23：0+C24：0）占總脂肪酸的含量分別為21.0%、68.8%、89.9%和10.15%。含量最高的脂肪酸依次為亞油酸（C18：2n6c）、油酸（C18：1n9c）、α-亞麻酸（C18：3n3）、棕櫚酸（C16：0）和硬脂酸（C18：0），含量分別為 53.70、20.20、12.00、6.26 g/100 g和2.56 g/100 g，這些脂肪酸占總脂肪酸的96%，而3種含量較高的UFA占總脂肪酸的87%，兩種含量較高的SFA占總脂肪酸的8.9%。黑枸杞油含n-6系列脂肪酸2種（亞油酸和γ-亞麻酸），含量為55.78 g/100 g；含n-3系列脂肪酸2種（α-亞麻酸和順-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸），含量為 12.10 g/100 g；n-6和n-3二者之和占總脂肪酸的68.80%。n-6系列中以亞油酸為主，n-3系列中以α-亞麻酸為主，這兩種必需脂肪酸分別占總脂肪酸的54.4%和12.2%，占不飽和脂肪酸的60.6%和13.5%。

PUFA具有抗炎、抗癌、抗肥胖、預(yù)防和治療心腦血管疾病、調(diào)節(jié)人體脂質(zhì)代謝、預(yù)防和改善老年癡呆等功能[25]。MUFA中油酸含量最高，占總脂肪酸含量的20.4%，油酸只有一個(gè)雙鍵，這種成分在橄欖油中的含量達(dá)70%以上，所以相比其它植物油，橄欖油更不容易氧化[16]。

多不飽和脂肪酸中亞油酸和α-亞麻酸是維持機(jī)體功能不可缺少、但機(jī)體不能合成、必須由食物提供的必需脂肪酸[26]。亞油酸含量最高，占總脂肪酸含量的54.4%。n-6系亞油酸在人體內(nèi)能轉(zhuǎn)變?yōu)棣?亞麻酸和花生四烯酸（arachidonic acid，AA），AA（C20：4n6）也是一種n-6多不飽和脂肪酸。在某種意義上γ-亞麻酸和AA也是必需脂肪酸。AA是人體大腦和視神經(jīng)發(fā)育的重要物質(zhì)，對(duì)提高智力和增強(qiáng)視敏度具有重要作用。由于人體一般不缺乏亞油酸，而更容易容易缺乏α-亞麻酸，因此含量高達(dá)12.00 g/100 g的黑枸杞油也是α-亞麻酸的良好來(lái)源。α-亞麻酸是所有n-3多不飽和脂肪酸的前體物質(zhì)[26]，可在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA），具有抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗炎作用以及神經(jīng)元保護(hù)功能，有助于預(yù)防癡呆[25]，有益于預(yù)防和治療癌癥、心腦血管病、糖尿病、類風(fēng)濕病、皮炎癥、抑郁癥、精神分裂癥、老年癡呆癥、過(guò)敏、哮喘、腎病和慢性肺炎等[12，21，25-26]。

PUFA和SFA的比值（PUFA/SFA值）低于0.45被認(rèn)為是不可取的。黑枸杞油PUFA/SFA值為6.78，遠(yuǎn)大于0.45，說(shuō)明其可以有效降低血清膽固醇和動(dòng)脈粥樣硬化以及預(yù)防心臟病，黑枸杞油是具備較大開(kāi)發(fā)價(jià)值的健康油脂。另外，黑枸杞油的AI值和Cox值分別為0.10和0.88均較低，顯示出脂肪酸的潛在健康效應(yīng)[24]。

Ili'c等[24]認(rèn)為，盡管脂肪酸譜相似，但不同枸杞果實(shí)中各脂肪酸的相對(duì)百分比存在明顯差異，導(dǎo)致不同枸杞果實(shí)的SFA、MUFA和PUFA含量不同；枸杞中亞油酸含量超過(guò)50%，枸杞中SFA含量最高的是棕櫚酸，其次是硬脂酸，這與本文研究結(jié)果基本一致。

2.2 不同方法提取的枸杞油的脂肪酸組成和含量

黑枸杞油以其特有的FAs為特征。表2列出了文獻(xiàn)報(bào)道的不同方法提取的枸杞油的脂肪酸組成和含量[15，20-21]。

表2 不同方法提取的枸杞油的脂肪酸組成和含量Table 2 Fatty acid composition and content of goji berry seed oil extracted by different methods g/100 g

由表2可知，直接壓榨法生產(chǎn)的黑枸杞油中含有13種脂肪酸[15]，Zhao等[21]采用超臨界CO2萃取技術(shù)得到的黑枸杞油檢測(cè)到16種脂肪酸。顯然，超臨界CO2萃取法制備的黑枸杞油試樣中脂肪酸的組成更豐富。這說(shuō)明利用超臨界CO2作萃取劑，從黑枸杞加工副產(chǎn)物果皮籽粒這類液體/固體物料中萃取、分離和純化有效成分，可減少生理活性物質(zhì)的損失，特別適合熱敏性物質(zhì)、易氧化物質(zhì)和揮發(fā)性物質(zhì)的分離提取。相比直接壓榨法，超臨界CO2萃取法提取的黑枸杞油α-亞麻酸的含量更高，棕櫚酸和油酸的含量略高，亞油酸含量略低，其它脂肪酸含量差異不明顯；與本試驗(yàn)樣本所含20種脂肪酸比較，兩種超臨界CO2萃取技術(shù)得到的油脂有16種相同的脂肪酸，本試驗(yàn)黑枸杞油樣本中亞油酸和γ-亞麻酸含量略低，而油酸含量略高，并且含有高達(dá)11.80 g/100 g的α-亞麻酸。因此推測(cè)這兩種黑枸杞油脂肪酸組成和含量的差異可能源于超臨界CO2萃取條件的不同以及黑枸杞來(lái)源的不同。另外，黑枸杞油相比紅枸杞油含有更多的脂肪酸成分，說(shuō)明黑枸杞油是一種亞油酸和亞麻酸含量較為豐富的高品質(zhì)新資源植物油。表3列出了8種不同植物油[27]和8種新資源籽油[12]的脂肪酸含量。

由表3可知，除葵花籽油外，黑枸杞油亞油酸含量高于所有植物油和新資源籽油；除胡麻油和紫蘇籽油外，黑枸杞油亞麻酸含量高于其它植物油和新資源籽油；黑枸杞油中油酸含量與大豆油、葵花籽油、胡麻油、紫蘇籽油和南瓜籽油接近；SFA中黑枸杞油棕櫚酸僅高于青花菜籽油、紫蘇籽油和石榴籽油，硬脂酸含量低于大豆油、花生油、葵花籽油、芝麻油、菠蘿籽油、木瓜籽油、釋迦果籽油、甜櫻桃種子和南瓜籽油。

表3 不同植物油和新資源籽油的脂肪酸含量比較Table 3 Comparison of fatty acid content between different vegetable oils and new seed oils %

2.3 黑枸杞油抗氧化成分生育酚的含量分析

生育酚即維生素E，是一種人體必需的脂溶性維生素，也是一種優(yōu)良的抗氧化劑和營(yíng)養(yǎng)劑，在堅(jiān)果、水果、蔬菜及糧食等作物中均存在。天然存在的維生素E有4 種生育酚（tocopherol，TP），即 α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚。其中α-生育酚生理活性最高。生育酚具有多種生物活性，對(duì)一些疾病有防治作用，如延緩機(jī)體衰老、避免冠狀動(dòng)脈硬化、防止白內(nèi)障發(fā)生、延緩早老性癡呆、維持正常的生殖機(jī)能、治療胃潰瘍、保護(hù)肝臟、調(diào)節(jié)血壓、輔助治療2型糖尿病等作用[28]。

黑枸杞油中生育酚含量為33.60 mg/100 g，α-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的含量分別為11.10、20.50 mg/100 g和1.99 mg/100 g。研究指出，常見(jiàn)的植物油，包括玉米油、橄欖油和花生油，含有高水平的α-TP和γ-TP[29]。生育酚是植物油中主要的脂溶性維生素，在不飽和脂肪酸通過(guò)斷鏈反應(yīng)的過(guò)氧化過(guò)程中起潛在的抗氧化作用[13]，植物油中的混合生育酚具有預(yù)防心血管疾病的有益生物功能，而生育酚的高含量有利于對(duì)氧化應(yīng)激的強(qiáng)保護(hù)，賦予油脂相對(duì)較好的貨架期[14]。橄欖油被認(rèn)為是迄今所發(fā)現(xiàn)的油脂中最適合人體營(yíng)養(yǎng)的油脂，Yalcin等[30]研究表明，橄欖油中生育酚的含量為26 mg/100 g～100 mg/100 g，與亞麻籽油、米糠油、葡萄籽油和紅花籽油的生育酚含量接近[15]，高于茶籽油、牡丹籽油、紫蘇籽油、杏仁油、番茄籽油和核桃油[13]。

3 結(jié)論

枸杞油是以枸杞資源中所含功效性天然產(chǎn)物為基礎(chǔ)所開(kāi)發(fā)的高附加值產(chǎn)品，賦予枸杞及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)以更高的經(jīng)濟(jì)效益。本文對(duì)由黑枸杞加工副產(chǎn)物制備的黑枸杞油中生育酚和脂肪酸的組成和含量進(jìn)行分析，與不同加工方式的黑枸杞油、不同種類的枸杞油、不同植物油和新資源籽油的脂肪酸組成和含量進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，黑枸杞油UFA含量高達(dá)88.70 g/100 g，其亞油酸、亞麻酸和油酸的含量高于大多數(shù)的植物油和新資源籽油，并且采用超臨界CO2萃取技術(shù)得到的油脂脂肪酸的組成更豐富，其生育酚的含量達(dá)33.60 mg/100 g。此研究為黑枸杞健康產(chǎn)業(yè)的開(kāi)發(fā)及其經(jīng)濟(jì)發(fā)展、后續(xù)進(jìn)一步研究、普及推廣促進(jìn)全面健康等提供一定的參考。