雙孢蘑菇中AbbHLH的表達、純化及多克隆抗體制備

趙詩睿，奚志嬡，孟德梅，2*，生吉萍

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.天津捷盛東輝保鮮科技有限公司，天津 300300；3.中國人民大學農業與農村發展學院，北京 100872）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）是目前世界上人工栽培種植范圍廣、產量高的食用菌之一，不僅富含蛋白質、維生素、礦物質等高營養物質，而且具有低熱量、低脂肪、味道鮮美等優點[1]，深受消費者的青睞。雙孢蘑菇主要以市場鮮銷為主，但其水分含量高、呼吸強度大、組織脆嫩，導致采后貯藏期僅有1 d～3 d，嚴重降低了產品的營養價值和商業價值[2-3]。采后持續發育是導致雙孢蘑菇采后品質損失的一個重要原因，在此過程中不僅出現菌膜破裂，成熟菌褶暴露，菌蓋開傘等變化，同時菌體釋放孢子不斷消耗子實體中的養分，造成營養物質在一定程度上出現遷移或缺乏，從而導致雙孢蘑菇的感官品質與營養價值大大降低[4-5]。因此，闡明雙孢蘑菇采后持續發育的機制，特別是對其分子調控機制的研究，對于開發更為有效的雙孢蘑菇保鮮方法具有重要的作用。

轉錄因子（transcription factors，TF）是一類可以通過與目標基因上游特定DNA序列中的順式反應元件相互作用而激活或抑制其下游基因表達的一種蛋白質分子，在調節植物次生代謝途徑中多種基因協同表達發揮著重要作用[6]。bHLH型轉錄因子在真核生物中存在十分廣泛，在轉錄因子家族中占有重要的地位，是植物體內第二大類轉錄因子家族。目前，已從各種光合真核生物中鑒定出2 400多個bHLH基因[7]。研究表明，bHLH轉錄因子在植物的許多重要生理過程，如生長發育、次生途徑代謝產物的合成與調控、抗逆反應等過程中發揮了越來越多的作用，成為近年來研究的熱點，其作用機理主要在于通過與靶基因啟動子上的特定基因位點發生特異性結合，來轉錄調控基因的表達[8-9]。例如，Zhu等[10]研究發現典型bHLH轉錄因子SlPRE2的過表達不僅促進了番茄幼苗的形態發育，而且減少了果實中色素的積累。與此類似，擬南芥中bHLH轉錄因子LoUDT1的過表達會導致花藥發育異常和花粉缺陷[11]。此外，Lu等[12]研究GhbHLH/HLH基因通過油菜素類固醇信號通路在棉花纖維發育中的特定作用。然而，bHLH轉錄因子在食用菌的采后繼續發育和衰老及脅迫反應中是否發揮著同樣重要的作用，其調控機制如何等均不清晰。

目前，關于bHLH轉錄因子在調控動植物生長發育和對抗各種脅迫過程中的功能及轉錄調控機理已經得到了大量研究，但是bHLH轉錄因子在食用菌領域的研究卻鮮有報道。因此，本文首次克隆鑒定雙孢蘑菇中的AbbHLH基因，并制備AbbHLH轉錄因子的多克隆抗體，為進一步探究其在雙孢蘑菇采后繼續發育中的調控機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及質粒

大腸桿菌 E.coli XL1-blue、E.coli BL21（DE3）感受態細胞、pET-28a（+）空載質粒：天津科技大學食品營養與安全重點實驗室保存。

1.1.2 培養基及試劑

LBK培養基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L、卡那霉素100 mg/L、pH7.0；LBK固體培養基另添加15 g/L瓊脂粉。

oligod（T）18引物：日本 Takara 公司；尿素、三羥甲基氨基甲烷[Tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸[4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid，Hepes]、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、苯甲磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluo ride，PMSF）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）：北京索萊寶科技有限公司；pfu高保真聚合酶和限制性內切酶及相關緩沖液：北京全式金生物技術有限公司；T4DNA連接酶及相關緩沖液：美國Thermo Fisher Scientific公司；弗式不完全佐劑、弗式完全佐劑：美國Sigma公司；Protein A SepHaroseTMCL-4B填料、CNBr-activated SepHaroseTM4 Fast Flow抗體純化介質、Ni SepHaroseTM6 Fast Flow親和純化介質：美國GE Healthcare公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗兔抗體：美國Jackson Immune Research公司；化學發光法EMSA試劑盒：上海碧云天生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 主要溶液配制

磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）：0.016 2 mol/L Na2HPO4、0.003 8 mol/L NaH2PO4、0.5 mol/L NaCl，pH7.4；漂洗液：1 mol/L 尿素、0.02 mol/L 咪唑，PBS定容；結合液：8 mol/L尿素、0.02 mol/L咪唑，PBS定容；洗脫液：8 mol/L尿素、0.5 mol/L咪唑，PBS定容；透析液母液：0.06 moL/L KCl、0.05 moL/L Tris、0.001 moL/L EDTA、0.012 moL/L Hepes、0.001 moL/L DTT、0.001 moL/L PMSF，pH7.4；包被液：0.01 mol/L Na2CO3、0.03 mol/L Na2CO3、pH9.6；Protein A 結 合 液 ：0.05 mol/L Tris、0.075 mol/L NaCl，pH7.0；Protein A 洗脫液：0.1 mol/L 甘氨酸、0.15 mol/L NaCl，pH2.5；CNBr結合液：0.1 mol/L NaHCO3、0.5 mol/L NaCl，pH8.3。

1.2 儀器與設備

9902 PCR儀：美國應用生物系統有限公司；Syner－gyH1/H1MF多功能酶標儀：美國伯騰儀器生產有限公司；BG-verMINI蛋白電泳儀：北京百晶生物技術有限公司；ZXDP-B2120電熱恒溫箱：上海智誠分析儀器制造公司；906超低溫冰箱：美國Thermo公司；ChampGel 50000凝膠成像儀、ChampGeI 5000 WB掃膜儀：北京賽智科技有限公司；5424R冷凍離心機：德國Eppendorf公司；HYC-940 4℃醫用冷藏柜：青島海爾特種電器有限公司；JY92-IIDN超聲波細胞破碎儀：天津億灣生物技術科技商貿公司。

1.3 實驗動物

新西蘭大白兔[生產許可證號SCXK（京）2015-0015]：北京斯貝福生物技術有限公司。

1.4 AbbHLH編碼區全長基因的克隆

根據雙孢蘑菇全基因組的測序結果及原核表達載體pET-28a（+）圖譜，使用Premier5.0軟件對AbbHLH基因（Genebank號：XP_007326351.1）進行引物設計，并分別加入酶切位點EcoR I和Hind III，如表1所示。

表1 擴增AbbHLH所用引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR amplification of AbbHLH gene

以反轉錄后的雙孢蘑菇互補DNA（complementary DNA，cDNA）為模板，利用表1中設計的特異性引物，進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增AbbHLH基因，再用限制酶EcoR I和Hind III進行雙酶切，將目的基因回收。PCR擴增的反應條件為95℃ 2 min、95℃ 30 s、58℃ 1 min、72℃ 1 min，35個循環；終延伸在72℃10 min為宜。反應結束后，取2 μL所得PCR產物進行0.1%瓊脂糖凝膠電泳分析，用DNA純化回收試劑盒將結果中條帶大小正確的PCR產物進行進一步純化。

1.5 pET-28a（+）-AbbHLH原核表達載體構建

將pET-28a（+）空載質粒和經PCR回收的目的片段分別用限制性酶EcoR I和Hind III在37℃恒溫條件下雙酶切3 h，再將分別獲得了黏性末端的載體和目的片段按照物質的量1∶3的配比混合，在T4DNA連接酶的作用下保持4℃連接8 h～12 h。然后通過化學轉化法，把重組質粒化轉入E.coli XL1-blue感受態細胞中，再從中挑取單克隆分別接種到LBK固體培養基中，保持37℃恒溫培養8 h～12 h[13]。提取質粒，用限制性酶EcoR I和Hind III做雙酶切驗證，其中驗證正確的部分質粒由金唯智生物科技有限公司進行質粒測序，將驗證測序正確的質粒命名為pET-28a（+）-AbbHLH。

1.6 重組蛋白在大腸桿菌中的誘導表達

采用化學轉化法，將pET-28a（+）-AbbHLH導入大腸桿菌E.coli BL21（DE3）感受態細胞中，于37℃在LBK平板上培養12 h。挑取單克隆，并于LBK液體培養基中培養8 h～12 h，然后將其按1∶20（體積比）轉到新鮮LBK液體培養基中繼續擴大培養，直至培養液OD600為0.6～0.8內。之后加入IPTG誘導劑（終濃度0.4 mmol/L），于25℃、220 r/min條件下誘導20 h使蛋白得到大量表達，同時設置無IPTG誘導劑的對照組。誘導結束后用PBS緩沖溶液重懸菌體沉淀，再離心（8 000 r/min，15 min）收集菌體，反復3次以充分清洗菌體。最后用PBS緩沖溶液將菌體溶解，超聲破碎獲得全蛋白，經離心（8 000 r/min，15 min）后分別收集沉淀和上清液，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析[14-15]。

1.7 重組蛋白純化

收集超聲裂解后的包涵體蛋白，用漂洗液重懸后，進行8 000 r/min、15 min離心處理，棄掉上清液，重復3次以去掉部分雜蛋白。然后將蛋白沉淀溶解在結合液中，經0.22 μm濾膜過濾后將濾液結合到預先處理好的Ni SepHaroseTM6 Fast Flow純化柱中，置于搖床上于4℃下結合2 h。待流穿液排干后，用結合液反復洗滌柱子，直到無蛋白從洗滌液中流出。最后用洗脫液重復洗脫目的蛋白，取樣后用SDS-PAGE電泳分析蛋白純度，將洗脫液置于-80℃下保存備用[16-18]。

1.8 重組蛋白復性

將純化后的重組蛋白用洗脫液稀釋后，放入預先處理好的透析袋中，并用夾子夾緊。將樣品置于4℃磁力攪拌器上分別于透析液I（含6 mol/L尿素）、II（含4 mol/L尿素）、III（含2 mol/L尿素）、IV（含1.5 mol/L尿素）、V（含1 mol/L尿素）、VI（含0.5 mol/L尿素）和透析液母液中各透析1次，每次12 h，且每次換液前取樣用于SDS-PAGE電泳分析。將復性后的蛋白溶液加入到過膜水沖洗過的超濾管中，離心濃縮（3 500 r/min，4℃）后用Bradford法測定濃縮后蛋白的濃度，直至濃度達到0.5 μg/mL后停止濃縮，蛋白樣品經SDS-PAGE電泳分析，再用ImageJ 1.51軟件進行灰度分析，蛋白純度大于80%的樣品置于-80℃下保存備用[19]。

1.9 多克隆抗體制備

首次免疫取400 μg純化后的重組蛋白樣品稀釋后，加入等體積的弗氏完全佐劑并混勻，充分乳化后多點背部皮下注射免疫實驗動物新西蘭大白兔，設置免疫前兔子耳靜脈血作為陰性對照。加強免疫時，向200 μg蛋白樣品中加入等體積的弗氏不完全佐劑混勻，每間隔10 d加強1次免疫，共進行3次加強免疫。最末次免疫1周后，取兔子耳靜脈血用來檢測抗體的效價，當效價達到20 000以上后，用麻醉劑麻醉兔子，取頸動脈血，于5 000 r/min離心20 min，收集30 mL血清，于-80 ℃下凍存[20]。

1.10 抗體效價的檢測

采用酶聯免疫吸附測定法測定抗血清效價[21-22]。一抗為免疫后兔血清，將純化后的抗原用包被液稀釋至濃度為 2 μg/mL，加至 96孔板（100 μL/孔），4 ℃包被8 h～12 h；用 PBST（含 0.05%（體積分數）Tween-20的PBS，pH7.4）洗滌2次，10%脫脂乳37℃恒溫孵育2 h；將多抗血清用PBS溶液進行梯度稀釋，設置空白對照為只加PBS，設置陰性對照為1∶200稀釋的陰性血清，各組均加入酶標板中于37℃恒溫孵育1 h，后用PBST溶液洗滌3次。二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1∶20 000稀釋），先在37℃恒溫孵育1 h，取出后用 PBST 溶液洗滌 3 次。經過 3，3′，5，5′，-四甲基聯苯胺顯色后用酶標儀測定OD450時的吸光值，當試驗組與陰性對照組血清的OD450比值＞2.0時為陽性，最大OD值的1/2對應稀釋倍數即為抗血清效價。

1.11 多克隆抗體的純化及特異性分析

1.11.1 Protein A純化

用Protein A結合液稀釋血清樣品，過0.22 μm的水系濾膜除去血清中的細胞殘渣和小顆粒雜質后，將濾液樣品注入以Protein A SepharoseTMCL-4B為填料的結合柱中，充分混勻后于25℃結合2 h。結合完成后用Protein A結合液沖洗柱子，直至流出的溶液中無蛋白為止。再用Protein A洗脫液重復洗脫以獲得較高純度抗體，用Western Blotting檢測純化后抗體特異性。

1.11.2 CNBr純化

將CNBr-activated SepHaroseTM4 Fast Flow填料加入結合柱預處理，用CNBr結合液平衡至pH8.3后，將純化后的抗原蛋白加入柱中混勻，置于搖床上4℃結合8 h～12 h。結合后用CNBr結合液反復沖洗柱子，直至流出液中無蛋白測出，然后加入Tris-HCl（0.1 mol/L，pH8.0）25℃封閉4 h。之后依次用溶液1（0.1 mol/L Tris、0.5 mol/L NaCl，pH3.5）及溶液 2（0.2 mol/L Gly、1 mol/L NaCl，pH3.5）交替沖洗，將柱中填料調至中性，最后用Protein A結合液平衡柱子。將Protein A純化后的血清抗體加入柱子中，與抗原蛋白25℃室溫下結合2 h，結合完成后收集洗脫液，并進行SDS-PAGE電泳分析抗體純度。每毫升純化完的抗體中加入300 μL 30%的甘油和10 μL 1%的NaN3，分裝后貯存于-80℃冰箱中，用Western Blotting檢測抗體特異性。

1.11.3 Western Blotting檢測抗體特異性

取20 μg經Bradford[23]法定量的雙孢蘑菇全蛋白，待SDS-PAGE電泳結束后，于40 V電壓下轉膜1 h，洗膜后加入10 mL 10%脫脂乳粉，置于4℃的水平搖床上密封12 h～18 h。加入一抗（Anti-AbbHLH多克隆抗體，1∶10 000稀釋），放入水平搖床中室溫25℃孵育1 h。取出后用TBST緩沖液（含體積分數0.05%Tween-20的 TBS，pH7.5）洗膜 3次，再加入 1 μL 二抗（HRP 標記的羊抗兔抗體，1∶10 000稀釋），放于搖床上室溫25℃孵育1 h，用TBST緩沖液沖洗膜3次，最后用ECL顯色試劑盒進行顯色[24]。

2 結果與分析

2.1 AbbHLH目的基因擴增產物的鑒定

基因AbbHLH的擴增見圖1。

圖1 基因AbbHLH的擴增Fig.1 Full length amplification of AbbHLH gene

由圖1可知，得到了片段大小為1 600 bp左右的PCR產物，與預期基本一致。

2.2 重組表達質粒的鑒定

重組表達載體的雙酶切驗證見圖2。

圖2瓊脂糖凝膠電泳表明獲得大小分別為1600bp和7 000 bp左右的基因片段，且大小和預期相符。經質粒測序后結果表明：成功克隆得到一條大小為1 599 bp的基因片段，該片段與雙孢蘑菇AbbHLH基因cDNA片段一致性達到99.37%，且未發現任何氨基酸突變，說明重組質粒pET-28a（+）-AbbHLH構建成功。

圖2 重組表達載體的雙酶切驗證Fig.2 Double digestion verification of recombinant plasmid pET-28a（+）-AbbHLH

2.3 重組質粒的原核表達

重組蛋白6×His-AbbHLH的誘導表達見圖3。

圖3 重組蛋白6×His-AbbHLH的誘導表達Fig.3 SDS-PAGE analysis of the expression of the recombinant protein 6×His-AbbHLH

由圖3可知，將IPTG誘導前后的全細胞表達結果進行對比后可以看出，含有6×His的AbbHLH蛋白在誘導后的表達量約為70 kDa。對誘導后的菌體進行超聲破碎后，收集上清液和破碎沉淀分別經SDS-PAGE分析，結果顯示出6×His-AbbHLH融合蛋白主要以包涵體的形式存在。

2.4 融合蛋白的純化及復性

SDS-PAGE檢測親和純化后的融合蛋白見圖4。

由圖4可知，純化后的融合蛋白純度達80%，較純化前有了明顯提高。

圖4 SDS-PAGE檢測親和純化后的融合蛋白Fig.4 SDS-PAGE analysis of the affinity purification of recombinant protein

融合蛋白之所以表達在包涵體中可能是由于菌體產生蛋白的速度過快而無足夠的時間形成正確空間結構，二硫鍵沒有正確配對[25]，從而導致蛋白之間發生了非特異性結合，使其溶解度和活性降低，因此需要將純化后的蛋白進行梯度透析以恢復其活性狀態。純化后蛋白的復性及濃縮見圖5。

圖5 純化后蛋白的復性Fig.5 Renaturation of purified protein

由圖5可知，重組蛋白在透析過程中較穩定，基本無降解。將復性后的蛋白用超濾管于4℃下濃縮以提高蛋白濃度，再用SDS-PAGE檢測，經Image J灰度軟件分析，其結果見圖6。

圖6 純化后蛋白的濃縮Fig.6 Concentration of purified protein

由圖6可知，融合蛋白純度達到了80%，經Bradford法測定濃縮后的蛋白濃度可達0.5 mg/mL，能夠用于后續免疫動物實驗的抗原。

2.5 多克隆抗體制備

間接酶聯免疫吸附測定法測定抗血清的效價見圖7。

圖7 間接ELISA法測定抗血清的效價Fig.7 Determination of the antiserum titer with ELISA method

由圖7可知，Anti-AbbHLH多克隆抗體的效價為102 400。

2.6 多克隆抗體純化與特異性分析

Western Blotting檢測Anti-AbbHLH的特異性見圖8。

圖8 Western Blotting檢測Anti-AbbHLH的特異性Fig.8 The specificity of anti-AbbHLH was detected by Western Blotting

由圖8可知，相對分子質量為70kDa左右出現了明顯的條帶，分子量大小與預期一致，說明Anti-AbbHLH多克隆抗體制備成功。通過Western Blotting實驗對Protein A純化后的抗體進行特異性檢測，發現抗體中大部分的雜帶已被去除，但仍含有部分非特異性結合的抗體。將CNBr純化后的抗體進行Western Blotting檢測，結果顯示純化后的抗體可與貯藏后0 h與2 h的雙孢蘑菇AbbHLH蛋白發生特異性結合，在約70 kDa處出現明顯的條帶，且基本無其它雜帶，表明得到了高純度、特異性強的多克隆抗體。

3 結論

本文成功獲得了以包涵體形式存在的6×His-AbbHLH融合蛋白，經純化復性后得到純度大于80%的水溶性抗原蛋白，用此抗原蛋白免疫新西蘭大白兔得到了效價為102 400的AbbHLH轉錄因子的多克隆抗體，用Protein A及CNBr對抗體進行親和純化后，用Western Blotting檢測該抗體能夠特異性識別采后不同貯藏時期雙孢蘑菇中的AbbHLH蛋白，表明所制備的多克隆抗體可用于雙孢蘑菇體內的AbbHLH蛋白檢測，為bHLH轉錄因子在雙孢蘑菇采后繼續發育中的作用機制的闡明提供了重要方法支持。