基于ROS/PI3K/Akt信號通路探討異牛肝菌素對人胃癌BGC-823細胞凋亡影響及機制

徐彥楠，趙俊霞，周娜靜，高 品，周晨明

(1.河北醫科大學教學實驗中心，河北 石家莊 050017；2.河北醫科大學細胞生物教研室，河北 石家莊 050017;3.河北醫科大學大型科研儀器設備共享服務平臺，河北 石家莊 050017)

胃癌是世界范圍內發病率最高的消化道惡性腫瘤之一，5年相對生存率僅約為20%，早期胃癌臨床無明顯癥狀，隨著疾病進展逐漸出現消化不良、胃脘疼痛、嘔血等癥，晚期患者常伴腹部腫塊、遠處淋巴結轉移等體征，放、化療等方式雖可有效治療胃癌，但易產生脫發、骨髓抑制等嚴重不良反應，尋求安全、有效的抗腫瘤藥物迫在眉睫[1-2]。腫瘤細胞凋亡減少是惡性腫瘤的病理學基礎之一，誘導細胞凋亡是抗腫瘤治療最有效的途徑，本課題組前期研究結果顯示，從褐環黏蓋牛肝菌子實體中分離純化的異牛肝菌素(iso-suillin)可有效抑制細胞增殖、誘導人肝癌細胞SMMC-7721細胞及人小細胞肺癌H446細胞凋亡，且與人胃癌BGC-823細胞增殖、凋亡密切相關[3-4]。當細胞代謝異常產生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)超過抗氧化系統的還原能力時，細胞處于氧化應激狀態，易引起凋亡相關基因的表達，繼而激活細胞凋亡程序[5]。有研究證實，ROS的生成在多種抗腫瘤藥物的促凋亡活性中有重要作用，而PI3K/Akt信號通路參與機體細胞存活、周期、凋亡、物質代謝等生物學過程，與多種腫瘤細胞的凋亡息息相關[6-7]。本課題擬通過觀察iso-suillin對人胃癌BGC-823細胞凋亡相關蛋白、ROS/PI3K/Akt信號傳導通路相關蛋白表達的調控作用，進一步闡明iso-suillin對人胃癌BGC-823細胞促凋亡的作用及分子機制，為iso-suillin成為一種潛在的抗腫瘤藥物提供基礎實驗依據和參考，現報告如下。

1 材料與方法

1.1材料 人胃癌細胞系BGC-823細胞保存于河北醫科大學細胞生物教研室。

1.2主要藥物與試劑 異牛肝菌素(河北師范大學生命科學院)，胎牛血清(美國Gibco公司)，青霉素(上海江萊生物科技有限公司)，鏈霉素(深圳華藥南方制藥有限公司)，Roswell Park Memorial Institute(RPMI)培養基(美國Invitrogen Life Technologies公司)，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)消化液(天津科密歐化化學試劑公司)，多聚甲醛、磷酸緩沖液(天津永大化學試劑開發中心)，Hoechst染色液(美國Amresco公司)，苯甲基磺酰氟(phenyl methyl sulfonyl fluoride，PMSE)細胞裂解液(美國Cell Signaling Technology公司)，兔抗Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、PI3K、Akt、mTOR(美國Bioworld Technology公司)，山羊抗兔二抗(康為世紀生物試劑公司)，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(美國Amresco公司)。

1.3主要儀器設備 普通顯微鏡(日本Olympus公司)，QP-80S二氧化碳培養箱(山東博科醫療器械有限公司)，醫用冰箱(青島海爾醫用低溫有限公司)，EV261電泳儀(比利時Consort公司)，熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，微量移液器(上海賽默飛世爾儀器有限公司)。

1.4細胞培養 配制內含10%胎牛血清、10 g/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI培養基，將人胃癌BGC-823細胞置于RPMI培養基中，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養，每隔24 h換液一次。待細胞形成致密單層后分瓶培養：棄去培養基，用磷酸緩沖液清洗1次后加入5 mL 0.04%的EDTA消化液，沿同一方向輕輕搖動培養瓶，待消化液充分浸潤后于顯微鏡下觀察。若多數細胞形態變圓，棄去EDTA消化液后加入10 mL新鮮RPMI培養基終止消化，而后反復吹打使細胞形成細胞懸液，以1∶2傳代培養，3 d傳代1次。

1.5方法

1.5.1Hoechst 33342熒光染色觀察人胃癌BGC-823細胞形態學變化 取培養至對數生長期的人胃癌BGC-823細胞，在細胞培養瓶中調整胞懸液使濃度為1×105個/mL，于96孔細胞培養板中接種，每組均設置3個復孔，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養24 h。分別加入7 μmol/L、14 μmol/L、28 μmol/L濃度的異牛肝菌素處理，依次記為低劑量組、中劑量組、高劑量組；另取一組記為對照組，給予等量生理鹽水處理，處理完畢后均在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下繼續培養48 h，終止培養。棄去上清液后采用磷酸緩沖液洗滌1次，并用4%多聚甲醛固定，30 min后再使用磷酸緩沖液洗滌3次，使用微量移液器吸凈液體后加入Hoechst染色液，于室溫下染色15 min后去除染液，再使用磷酸緩沖液洗滌3次后使用吸凈微量移液器液體，每孔加入適量熒光淬滅劑，于熒光顯微鏡下觀察。細胞凋亡率=凋亡細胞數量/總細胞數量×100%。

1.5.2蛋白免疫印跡法檢測異牛肝菌素處理后人胃癌BGC-823細胞凋亡相關蛋白的表達水平 分組及細胞處理同1.5.1，將不同濃度異牛肝菌素作用于人胃癌BGC-823細胞48 h后棄去培養液，磷酸緩沖液洗滌2次，并用微量移液器吸凈多余液體；加入80～120 μL細胞裂解液(PMSE與細胞裂解液按1∶100混合)，于4 ℃條件下裂解30 min，分別提取各組細胞總蛋白。將樣本與2倍濃度上樣緩沖液以體積1∶1混合，經聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)(分離膠為12%)后轉至PVDF膜，采用含0.1% Tween的5%脫脂奶粉于室溫下封閉2 h后進行洗膜，洗膜后加入1∶500稀釋的兔抗人Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase -9孵育，于4 ℃條件下過夜，TBST緩沖液洗滌3次后，采用山羊抗兔IgG抗體(1∶1 000，二抗)標記，將漂洗過的PVDF膜置于孵育盒中，37 ℃溫箱中孵育1 h，將PVDF膜置于凝膠成像系統中進行發光等操作，采用凝膠圖像分析軟件測定各蛋白條帶的積分光密度值(integrated optical density，IOD)，Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase -8、Caspase -9蛋白條帶的IOD與對應的β-actin條帶光密度比值為Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase -8、Caspase -9的表達的相對水平，重復3次，取平均值。

1.5.3活性氧熒光探針染色法(Dichlorfoluorescein diacetate，DCFH-DA)檢測異牛肝菌素處理后人胃癌BGC-823細胞ROS水平 取處于對數生長期的人胃癌BGC-823細胞，經0.25%胰蛋白酶消化后制成5×107的單細胞懸液，于96孔細胞培養板中接種，每組均設置3個復孔，細胞貼壁后棄去培養液，加不同濃度異牛肝菌素干預48 h，采用磷酸緩沖液洗滌2次，加入DCFH-DA染色液，于37 ℃恒溫細胞培養箱內孵育30 min，用預冷的磷酸緩沖液洗滌3次，于倒置熒光顯微鏡下(發射波長為530 nm)觀察。

1.5.4蛋白免疫印跡法檢測PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達水平 檢測方法同1.5.2，其中一抗為兔抗人PI3K、Akt、mTOR，二抗選用山羊抗兔IgG抗體標記。

1.6統計學方法 應用SPSS 24.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1干預后各組人胃癌BGC-823細胞形態學變化 Hoechst 33342熒光染色顯示隨著異牛肝菌素濃度增加，呈亮藍色的細胞越來越多，染色質凝聚，出現凋亡小體，即細胞凋亡。與對照組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組凋亡率均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 不同濃度iso-suillin干預后各組凋亡率比較Table 1 Comparison of apoptosis rate in each group after intervention with iso-sullin at different concentrations

圖1 各組人胃癌BGC-823細胞形態學變化(Hoechst33342熒光染色 ×200)

2.2干預后各組人胃癌BGC-823細胞凋亡相關蛋白表達水平 干預后，蛋白免疫印跡法檢測異牛肝菌素對人胃癌BGC-823細胞凋亡相關蛋白結果顯示，與對照組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9相對表達量均增加，抗凋亡蛋白Bcl-2相對表達量降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 不同濃度iso-suillin干預后人胃癌BGC-823細胞凋亡相關蛋白表達水平比較Table 2 Comparison of expression levels of apoptosis-related proteins in human gastric cancer BGC-823 cells after intervention with iso-sullin at different concentrations

圖2 各組人胃癌BGC-823細胞凋亡相關蛋白表達水平

2.3干預后各組人胃癌BGC-823細胞ROS水平 干預后，DCFH-DA檢測異牛肝菌素處理后人胃癌BGC-823細胞ROS水平結果顯示，隨著異牛肝菌素濃度的增加，人胃癌BGC-823細胞ROS細胞漿著色密度增加，提示ROS水平增加，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組人胃癌BGC-823細胞ROS水平均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3、圖3。

表3 不同濃度iso-suillin干預后各組人胃癌BGC-823細胞ROS水平比較Table 3 Comparison of ROS level of human gastric cancer BGC-823 cells in each group after the intervention with iso-sullin at different concentrations

圖3 各組人胃癌BGC-823細胞ROS水平(活性氧熒光探針染色法 ×200)

2.4PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達水平 干預后，蛋白免疫印跡法檢測異牛肝菌素處理后人胃癌BGC-823的PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達結果顯示，與對照組比較，隨著異牛肝菌素濃度的增加， 低劑量組、中劑量組、高劑量組PI3K、Akt、mTOR蛋白相對表達量均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4、圖4。

表4 不同濃度iso-suillin干預后各組PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達水平比較Table 4 Comparison of PI3K/Akt signal pathway-related protein expression levels in each group after the intervention with iso-sullin at different concentrations

圖4 PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達水平

3 討 論

胃癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，我國胃癌發病率、病死率接近全球范圍內胃癌發病及病死總數的50%，嚴重威脅居民生命健康[8]。既往研究表明，胃癌惡性程度較高，確診時多數處于中晚期，手術、放療、生物治療等雖可緩解胃癌患者臨床癥狀，但伴隨著嚴重的不良反應、腫瘤耐藥等問題，患者臨床預后欠佳，已成為制約胃癌治療的瓶頸[9]。因此，尋找高效、毒性低的抗腫瘤藥物尤為關鍵。基因突變引起細胞內信號傳導紊亂導致的細胞增殖失控、細胞凋亡受阻是致使胃癌發生的主要因素，細胞凋亡可通過處理衰老、受損的細胞維持組織內穩態環境，但在退行性條件下，凋亡系統被破壞易致癌癥、自身免疫性疾病等癥，目前臨床多數抗腫瘤藥物通過誘導腫瘤細胞凋亡達到治療目的[10]。iso-suillin是從褐環黏蓋牛肝菌子實體中分離純化得到的異戊二烯基酚類化合物，具有抗氧化、提高機體耐受力等多種藥用價值，同時可誘導部分腫瘤細胞凋亡，毒不良反應低于順鉑等傳統抗腫瘤藥物。Zhao等[11]研究顯示，異牛肝菌素可通過線粒體介導的內在途徑及死亡受體介導的外在途徑調節Caspases家族相關蛋白的表達，繼而誘導腫瘤細胞凋亡，可作為胃癌、心腦血管腫瘤等疾病的潛在治療方法。

為明確iso-suillin對胃癌細胞凋亡的影響，本研究將異牛肝菌素作用于人胃癌BGC-823細胞，通過Hoechst 33342熒光染色實驗顯示，隨著異牛肝菌素濃度增加，呈亮藍色的細胞越來越多，染色質凝聚，出現凋亡小體，且呈現劑量依賴性，證實異牛肝菌素可誘導腫瘤細胞凋亡發揮抗腫瘤作用。通過蛋白免疫印跡法進一步對人胃癌BGC-823細胞凋亡相關蛋白檢測顯示，與對照組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組促凋亡蛋白Bax相對表達量增加，抗凋亡蛋白Bcl-2相對表達量降低，此外，Caspase-3、Caspase -8、Caspase -9相對表達量均增加，證實腫瘤細胞發生了線粒體凋亡。Bax是Bcl-2家族經典的促凋亡因子，可在線粒體外膜成孔，破壞線粒體后增加細胞色素C的釋放，最終激活Caspase -9，致使腫瘤細胞凋亡。此外，細胞內源性凋亡起始于DNA破壞或細胞受損，外源性凋亡起始于細胞外配體或死亡受體間相互作用，二者均依賴于Caspase家族成員的激活，其中Caspase-3可通過自我催化引起蛋白酶級聯反應，特異性裂解底物而致細胞凋亡；Caspase-8可誘導死亡配體與其特異性受體結合，形成誘導死亡信號復合體而促使腫瘤細胞凋亡[12-13]。最新研究表明，引起腫瘤細胞代謝異常產生的大量ROS可使細胞處于氧化應激狀態，從而激活細胞凋亡程序，在多種抗腫瘤藥物的促凋亡活性中有關鍵作用[14]。Fasoulakis等[15]學者研究顯示，細胞內ROS水平增加可將腫瘤細胞周期阻滯在G1期、誘導細胞凋亡，ROS介導的死亡受體上調而增加腫瘤壞死因子相關凋亡受體發揮作用，在胃癌、膀胱癌、肝癌等惡性腫瘤中均有顯著作用。本研究通過DCFH-DA檢測異牛肝菌素處理后人胃癌BGC-823細胞ROS水平亦顯示，iso-suillin可通過增加細胞ROS水平誘使腫瘤細胞代謝異常，繼而促使細胞凋亡。PI3K作為細胞內的磷脂酰肌醇激酶，本身具有絲氨酸的活性，在接受酪氨酸激酶、G蛋白偶聯受體信號后，自身發生磷酸化，使Akt從細胞質轉移至細胞膜上，參與細胞增殖、分化、凋亡等多種細胞功能的調節[16-17]。本研究通過蛋白免疫印跡法檢測PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達水平顯示，PI3K、Akt、mTOR蛋白活性是被抑制的，進一步顯示Akt下游相關蛋白活性也被抑制，且促使腫瘤細胞凋亡，推測可能與PI3K、Akt迅速失活有關，哺乳動物細胞凋亡多為級聯反應，異牛肝菌素可能通過抑制PI3K/Akt信號通路，誘導人胃癌BGC-823細胞發生凋亡，但其是否還通過其他機制致使胃癌細胞死亡還有待進一步研究。

綜上所述，iso-suillin可誘導人胃癌BGC-823細胞凋亡，發生機制可能與活化了Caspase家族蛋白、上調了ROS表達、下調PI3K、Akt、mTOR相關。但其是否同時通過其他機制誘導人胃癌BGC-823細胞凋亡還需深入研究。