鹽脅迫下園林植物彩葉樹響應(yīng)菌根共生的比較轉(zhuǎn)錄組分析

陳 蓋， 溫可馨， 司 冰

(1.唐山工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北唐山 063299； 2.渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西渭南 714026)

土壤是植物生長發(fā)育的重要載體，然而全球范圍內(nèi)超過7%的土地受到不同程度鹽脅迫的影響[1]。鹽脅迫是對(duì)作物生長發(fā)育及產(chǎn)量形成最不利的環(huán)境脅迫因子之一，其潛在的分子機(jī)制與多種生物途徑和過程有關(guān)，包括滲透調(diào)節(jié)、離子泵、氧化途徑以及營養(yǎng)障礙等代謝過程的改變[2]；分子水平上，鹽脅迫可限制細(xì)胞分裂、DNA擴(kuò)增，甚至誘導(dǎo)產(chǎn)生基因毒性[3]。此前的研究發(fā)現(xiàn)，植物體具有多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路協(xié)助植物適應(yīng)鹽脅迫，例如鹽脅迫敏感系統(tǒng)(SOS)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級(jí)聯(lián)、磷脂酰肌醇(PI)和脫落酸(ABA)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[4]。此外，為應(yīng)對(duì)鹽脅迫，分子信號(hào)傳導(dǎo)可以激活其他轉(zhuǎn)錄因子(TF)，TF可增強(qiáng)和激活基因調(diào)控信號(hào)，從而重新調(diào)節(jié)細(xì)胞離子、滲透和活性氧(ROS)的穩(wěn)態(tài)[5]。

叢枝菌根(arbuscular mycorrhizal，AM)真菌是一種重要的土壤有益微生物，它可與80%以上的陸生植物形成互惠互利的共生關(guān)系，這種共生關(guān)系可促進(jìn)植物生長并改變植物的形態(tài)、生理和營養(yǎng)水平[6]，從而提高對(duì)多種非生物脅迫因素的抵抗力，包括養(yǎng)分貧瘠、高溫、寒冷、干旱和鹽脅迫[7]。在鹽脅迫條件下，接種AM真菌的植物可以增強(qiáng)對(duì)離子穩(wěn)態(tài)、滲透平衡和抗氧化酶活性的調(diào)節(jié)[8]，同時(shí)也可提高光合活性以改善養(yǎng)分活化、營養(yǎng)獲取和植物的水分吸收[7]。然而，以往對(duì)鹽脅迫環(huán)境改善機(jī)制的研究主要集中于形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征，很少對(duì)接種AM真菌的植物在基因組范圍內(nèi)的基因表達(dá)進(jìn)行探索，這限制了AM真菌在植物抗鹽性方面的應(yīng)用認(rèn)知[9]，因此，須要對(duì)鹽脅迫條件下AM真菌改善機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的分子水平分析。

彩葉樹是指在整個(gè)生長季節(jié)，全部或部分葉色與自然綠色有明顯區(qū)別的木本植物類群，基本特征是具備一致的變色期、較長的觀賞期和整齊的落葉期[10]。目前，紫葉稠李、金葉女貞、雞爪槭、五角楓、金葉紅瑞木等10余種彩葉樹種廣泛引種栽植于我國各省市道路、街道兩側(cè)及公園中，是園林綠化的重要組成[11]。然而在實(shí)地栽種中，在各個(gè)地區(qū)均呈現(xiàn)出植株生長勢弱、適應(yīng)性差、病蟲害嚴(yán)重等現(xiàn)象。許多彩葉樹在鹽漬土壤中生長不良，表現(xiàn)出葉片焦枯、葉色灰暗等現(xiàn)象[12]。在前人的研究中，接種AM真菌可有效調(diào)節(jié)100 mmol/L鹽脅迫下彩葉樹的滲透脅迫、氧化損傷和離子應(yīng)力，從而促進(jìn)植株的生長發(fā)育[13]，這些結(jié)果為進(jìn)一步研究彩葉樹接種AM真菌的耐鹽性分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。本研究中，借助Illumina HiSeqTM2500測序平臺(tái)分析彩葉樹雞爪槭(Acerpalmatum)葉片組織中的全基因轉(zhuǎn)錄變化，以探索AM真菌誘導(dǎo)耐鹽性的分子機(jī)制。研究結(jié)果可為更全面地了解AM真菌在耐鹽性中的作用提供理論支持，并啟動(dòng)有效的基因工程策略。

1 材料和方法

1.1 供試時(shí)間與供試材料

試驗(yàn)于2021年5—8月于渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院試驗(yàn)場大棚中進(jìn)行。供試彩葉樹品種為雞爪槭，購自楊凌益恒園林綠化有限公司。種子采用表面滅菌后在培養(yǎng)皿中的3層濕濾紙上，在 26 ℃ 環(huán)境下黑暗處理催芽4 d。

供試培養(yǎng)基質(zhì)為體積比為2 ∶1的土壤與珍珠巖(直徑<3 mm)，高壓蒸汽滅菌(121 ℃，1×105kPa，4 h)后，冷卻備用。土壤理化性質(zhì)：pH值為7.11，有機(jī)質(zhì)含量為18.32 g/kg，全氮含量為 0.95 g/kg，堿解氮含量為78.26 mg/kg，速效磷含量為21.03 mg/kg，速效鉀含量為110.64 mg/kg。供試NaCl為優(yōu)級(jí)純，購自上海玉博生物科技有限公司。

供試AM真菌為根內(nèi)根孢囊霉(Rhizophagusintraradices)，購自北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，直接用作接種菌劑，接種菌劑由土壤和孢子構(gòu)成，孢子數(shù)>100個(gè)/g基質(zhì)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，設(shè)置4個(gè)處理：CK(不接種叢枝菌根真菌，不設(shè)置鹽脅迫處理)、AM(接種叢枝菌根真菌，不設(shè)置鹽脅迫處理)、SS(不接種叢枝菌根真菌，設(shè)置鹽脅迫)、AS(接種叢枝菌根真菌，設(shè)置鹽脅迫)。每個(gè)處理重復(fù)3次。

盆栽器具為桶形，盆高為17 cm，半徑為8 cm，每盆培養(yǎng)基質(zhì)5 kg。將催芽的種子每盆1粒轉(zhuǎn)移至盆栽土中，加入200 mL育苗專用營養(yǎng)液，并保持60%土壤持水量。接種AM真菌的處理須將20 g AM真菌菌劑與滅菌的培養(yǎng)基質(zhì)混合，不接種處理即采用經(jīng)高溫滅菌處理的菌劑等量加入。培養(yǎng)30 d后在鹽脅迫處理中加入100 mL濃度為100 mmol/L的NaCl溶液，對(duì)照中加入等量蒸餾水。脅迫處理后30 d收獲植株，共培養(yǎng)60 d。

1.3 樣品采集及測定分析

1.3.1 生物量、菌絲定殖率、叢枝侵染率及泡囊豐富度測定 培養(yǎng)結(jié)束后，將植株全部取出，小心清洗以獲得完整根系，將根系切成1 cm的小段，采用臺(tái)盼藍(lán)染色，光學(xué)顯微鏡下用網(wǎng)格交叉記數(shù)法計(jì)算菌絲定殖率、叢枝定殖率及泡囊豐富度，具體方法參照Kormanik等描述的步驟[14]進(jìn)行。生物量為鮮質(zhì)量，采用電子天平稱量記錄。

1.3.2 轉(zhuǎn)錄組測定

1.3.2.1 RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建和高通量測序 使用RNA prep Pure Plant Kit[天根生化科技(北京)有限公司]分離12(4×3)張葉片樣品的總RNA。文庫構(gòu)建和RNA-Seq分析由Biomarker Biotechnology Corporation(中國，北京)進(jìn)行。首先，使用NEBNext? poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module[紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司]從總RNA中富集提取poly(A) mRNA，將poly(A) mRNA片段化。這些中斷的片段被用作第一鏈和第二鏈cDNA 合成的模板。然后對(duì)得到的cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、磷酸化和連接到測序接頭；通過PCR擴(kuò)增合適的產(chǎn)物以構(gòu)建cDNA文庫。最后，使用Illumina HiSeqTM2500對(duì)12個(gè)純化的文庫進(jìn)行高通量測序。

1.3.2.2 高通量測序RNA-Seq讀取映射和功能注釋 進(jìn)行RNA-Seq分析后，通過修剪接頭并去除低質(zhì)量的原始序列以獲得高質(zhì)量的讀數(shù)序列。使用HISAT2軟件將讀數(shù)映射到雞爪槭參考基因組(GCA_001876935.1，Acerpalmatum2017)。使用StringTie軟件對(duì)映射的讀數(shù)進(jìn)行組裝和定量分析，作為每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬個(gè)片段映射(FPKM)值。來自參考基因組的原始基因的非翻譯區(qū)(UTR)，在連續(xù)映射讀取的基礎(chǔ)下，擴(kuò)展到上游和下游以合成和優(yōu)化基因結(jié)構(gòu)[15]。此外，通過比較基因組的原始注釋信息，進(jìn)行一一對(duì)比找到以前未注釋的轉(zhuǎn)錄區(qū)域(即過濾長度大于50個(gè)氨基酸的短多肽產(chǎn)物和單個(gè)外顯子區(qū)域后的新基因)。對(duì)于新基因，對(duì)潛在的新轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行功能注釋，即將測序得到的轉(zhuǎn)錄本與公開可用的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Nr、Swiss-Prot、GO、COGs、KOG、Pfam、egg-NOG和KEGG)進(jìn)行比對(duì)，使用BLASTx算法獲取對(duì)比值。

1.3.2.3 差異表達(dá)基因(DEGs)分析 每個(gè)基因的表達(dá)水平由每千個(gè)堿基外顯子每百萬個(gè)片段映射值決定。使用DESeq軟件進(jìn)行成對(duì)比較中的差異表達(dá)基因分析。通過計(jì)算所有基因的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)和倍數(shù)變化對(duì)數(shù)(log2C)。結(jié)合GO注釋結(jié)果進(jìn)行功能描述，接著對(duì)DEGs進(jìn)行KEGG Pathway富集分析，結(jié)合KEGG注釋結(jié)果獲取差異基因相關(guān)的生化代謝途徑及生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。當(dāng)轉(zhuǎn)錄本符合FDR≤0.01和log2C的絕對(duì)值≥1 時(shí)，認(rèn)為該轉(zhuǎn)錄本存在功能富集。轉(zhuǎn)錄組測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3.3 實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證差異基因準(zhǔn)確性 將保存于-80 ℃的葉片樣品快速研磨，采用轉(zhuǎn)基因Ⅱ一體化引物試劑盒TransScript Ⅱ All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)提取樣本總RNA，并將總RNA轉(zhuǎn)化為單鏈cRNA。采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因特異性引物(表1)。使用TransStart Top Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)，并在Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)上1式3份進(jìn)行PCR定量復(fù)孔檢測。

每個(gè)反應(yīng)包含10 μL 2×TransStart Top Green qPCR SuperMix、2.0 μL cDNA樣本、0.4 μL基因特異性引物、7.6 μL ddH2O，最終體積為20 μL。利用比較的方法計(jì)算每個(gè)樣本的mRNA與內(nèi)參基因AcerPM1的相對(duì)表達(dá)量，以2-ΔΔCT表示[16]。最后，通過 qRT-PCR和RNA-Seq分析比較SS、AS處理中基因表達(dá)的變化趨勢，以評(píng)估測序結(jié)果是否可靠。基因驗(yàn)證委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

表1 qRT-PCR 引物序列信息

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2013進(jìn)行初步數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 23.0軟件中的單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢測分析(α=0.05)，所有圖形均采用Origin 8、R語言軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下菌根共生對(duì)彩葉樹生物量累積及根系侵染強(qiáng)度的影響

由圖1-A可知，在生物量中，以AM處理生物量累積最高，SS處理生物量累積最低，各處理表現(xiàn)為AM>CK>AS>SS，其中AM與CK處理無顯著差異，二者皆顯著大于SS和AS處理，且SS處理顯著小于AS處理；與SS處理相比，CK、AM、AS處理分別顯著提高104.31%、119.17%、64.51%。由圖1-B可知，在沒有接種AM真菌的處理中沒有定殖情況，因此未列出；接種叢枝菌根真菌情況下，整體表現(xiàn)為菌絲定殖率大于叢枝定殖率，且以泡囊定殖率最低。在AM處理中，菌絲、叢枝及泡囊的定殖率分別為78.33%、72.16%、59.67%，鹽處理(AS)下，菌絲、叢枝及泡囊的定殖率分別為54.33%、52.67%及39.05%；且在任一定殖率指標(biāo)中，皆以AM處理顯著大于AS處理。

2.2 鹽脅迫及菌根共生下彩葉樹轉(zhuǎn)錄本的原始數(shù)據(jù)分析

為了全面了解AM真菌對(duì)鹽脅迫下彩葉樹葉片轉(zhuǎn)錄組的影響，基于高通量RNA-Seq建立了12個(gè)cDNA文庫。去除低質(zhì)量讀段、不確定堿基、過短序列以及可能污染的序列后，總共獲得了高質(zhì)量序列數(shù)20 600 209～29 151 214，高質(zhì)量堿基數(shù) 6 159 570 306～8 818 959 652，其中Q30>93.58%，鳥嘌呤和胞嘧啶(GC)所占的比例為47.58%～48.71%。此外，注釋比例表明映射到雞爪槭基因組(GCA_001876935.1，Acerpalmatum2017)的讀數(shù)比例皆較高，為81.54%～83.81%(表2)。上述結(jié)果表明該RNA-Seq測序的12組cDNA文庫可用作進(jìn)一步分析的測序數(shù)據(jù)。

2.3 鹽脅迫及菌根共生下彩葉樹原始轉(zhuǎn)錄本的功能注釋及分類

根據(jù)RNA-Seq測序結(jié)果，基于與參比基因組(GCA_001876935.1，Acerpalmatum2017)進(jìn)行對(duì)比總共鑒定出6 019個(gè)原始轉(zhuǎn)錄本，且都均勻分布在染色體上。功能注釋見圖2，在上述數(shù)據(jù)庫中總共注釋得到4 672個(gè)新基因。可注釋到COG、GO、KEGG、KOGPfam、Swiss-Prot、egg-NOG及Nr的新基因數(shù)分別為626、1751、1181、1920、1 660、2 190、3 057 及4 644個(gè)，分別占總的新基因數(shù)的13.40%、37.48%、25.28%、41.10%、35.53%、46.88%、65.43%及99.40%。

表2 鹽脅迫下菌根共生下彩葉樹轉(zhuǎn)錄本的原始數(shù)據(jù)分析

2.4 鹽脅迫及菌根共生下彩葉樹轉(zhuǎn)錄本的差異基因(DEGs)分析

由圖3-A可知，當(dāng)進(jìn)行鹽脅迫處理且無論接種叢枝菌根與否的對(duì)比組中(AM/SS、CK/SS)，差異基因的下調(diào)數(shù)量整體上是上調(diào)數(shù)量的2倍。對(duì)于接種AM真菌處理中，在沒有和有鹽脅迫對(duì)比下(CK/AM、SS/AS)，上調(diào)的DEGs數(shù)量則幾乎是下調(diào)的DEGs數(shù)量的2 倍。這些結(jié)果表明，雞爪槭中更多的DEGs響應(yīng)于鹽脅迫而發(fā)生下調(diào)，而更多的DEGs響應(yīng)于接種AM真菌而上調(diào)。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)41個(gè)基因在比較CK/SS處理時(shí)下調(diào)，但在比較SS/AS處理時(shí)卻上調(diào)。此外，在比較SS/AS處理時(shí)，有286個(gè)基因上調(diào)，但在比較CK/SS處理時(shí)，這些基因的表達(dá)水平?jīng)]有差異。因此，可以推斷具有這些表達(dá)特征的DEGs可能是鹽脅迫條件下響應(yīng)菌根共生的關(guān)鍵基因。

為了進(jìn)一步探索來自4個(gè)不同比較處理的DEGs之間的關(guān)系，構(gòu)建了不同比較處理間DEGs的Venn圖。由圖3-B可知，僅在接種與不接種AM真菌條件下(CK/SS、AM/AS)，共有798個(gè)DEGs，其中未接種的植物特有1 630個(gè)DEGs。這些結(jié)果表明，在接種和未接種AM真菌的植物對(duì)鹽脅迫的分子反應(yīng)存在明顯差異。此外，為了識(shí)別鹽脅迫下AM真菌特異性調(diào)控的DEGs，SS/AS與CK/AM僅共有1個(gè)共同DEGs，這表明大多數(shù)DEGs在SS和AS處理的比較可能與AM真菌調(diào)節(jié)的鹽脅迫有關(guān)。因此SS/AS中的這些DEGs(455個(gè))可用于后續(xù)基因功能表征以分析由AM真菌誘導(dǎo)耐鹽性的可能分子機(jī)制。

2.5 鹽脅迫及菌根共生下彩葉樹差異基因(DEGs)的功能注釋

2.5.1 鹽脅迫及菌根共生下彩葉樹DEGs的GO功能注釋與分類 為了解釋AM真菌在鹽度脅迫中的改善機(jī)制，研究了在SS/AS比較中的455個(gè)DEGs的特征。對(duì)于GO分析，455個(gè)DEGs中有247個(gè)被分配到至少1個(gè)GO分類中，其主要涉及生物過程、分子功能和細(xì)胞成分(圖4)；DEGs顯著富集(KS值≤0.05)在32個(gè)過程中產(chǎn)生富集(表3)。這些富集的GO term在鹽度脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)中的生物過程高度相關(guān)，包括蛋白質(zhì)生物合成相關(guān)過程(GO：0006383、GO：0006452、GO：0006449、GO：0045901、GO：0045905、GO：0006414和GO：0006415)、ATP生物合成過程(GO：0006754)、蛋白質(zhì)谷胱甘肽化(GO：0010731)、細(xì)胞分化調(diào)控(GO：0045595)、氮同化相關(guān)過程(GO：0010167、GO：0009309、GO：0009084)、呼吸電子傳遞鏈(GO：0022904)以及類胡蘿卜素代謝過程(GO：0043288)。

2.5.2 鹽脅迫及菌根共生下彩葉樹DEGs的KEGG功能注釋與富集分析 基于京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析中，455個(gè)DEGs中有98個(gè)被分配了KEGG ID并被分類為58個(gè)途徑(圖5)。在圖6中突出顯示了前 20 條富集途徑(基于q值)，其中，DEGs顯著(q值≤0.05)富集在與次級(jí)代謝物生物合成相關(guān)的3條途徑中，包括苯丙烷、黃酮類、二苯乙烯類、二芳基庚烷類和姜酚的通路代謝(圖5、圖6)，這些通路可能與耐鹽性有關(guān)。

2.6 鹽脅迫及菌根共生下彩葉樹DEGs的qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA-Seq數(shù)據(jù)的可靠性，在SS/AS的455個(gè)DEGs中隨機(jī)挑選了6個(gè)DEGs進(jìn)行qRT-PCR分析。通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，Gene23660、Gene26140、New_Gene4379、Gene20176、Gene20188、New_Gene23129的log2FC值分別為9.66、3.26、3.39、2.71、4.64、2.54(圖7)，這6個(gè)基因的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄本的RNA-Seq分析結(jié)果高度一致。這些結(jié)果表明DEGs分析是準(zhǔn)確可靠的。

表3 鹽脅迫下菌根共生下彩葉樹DEGs的GO分類

3 討論與結(jié)論

叢枝菌根真菌在土壤中廣泛存在，是重要的功能性微生物組成部分[7]。關(guān)于AM真菌改善鹽脅迫的研究已經(jīng)在煙草、黃瓜、玉米以及小麥等多種植物中得到證實(shí)[17-19]。為了更好地了解AM真菌對(duì)植物耐鹽性的潛在分子機(jī)制，在鹽脅迫下給彩葉樹雞爪槭接種AM真菌，并進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析，建立了12個(gè)測序文庫，確定了6 019個(gè)潛在基因，注釋得到4 672個(gè)新基因。此外，在鹽脅迫條件下由AM真菌誘導(dǎo)的455個(gè)差異基因顯著富集在幾個(gè)GO和KEGG通路中，這些通路涉及耐鹽機(jī)制，包括植物細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境的改善、氮代謝相關(guān)過程以及可能的光保護(hù)機(jī)制。這些途徑進(jìn)一步證實(shí)AM真菌可調(diào)控離子滲透和氧化應(yīng)激的影響，并改善鹽度脅迫下的氮代謝和光保護(hù)機(jī)制。

3.1 鹽脅迫下菌根共生涉及的細(xì)胞改善作用

首先，在鹽脅迫條件下，抗氧化酶的分泌與非酶化合物的合成在清除過量ROS以維持氧化平衡和減少非生物脅迫對(duì)細(xì)胞中的影響方面起著重要作用，如過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、腺苷高半胱氨酸酶(AHCY)、谷胱甘S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、抗壞血酸(AsA)、谷胱甘肽(GSH)和硫氧還蛋白(TRX)等[18，20-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，許多編碼POD、GST、MDHAR、AHCY和TRX的DEGs發(fā)生上調(diào)表達(dá)并參與了多種抗氧化系統(tǒng)，包括抗壞血酸-GSH循環(huán)和過氧還蛋白/硫氧還蛋白(PrxR/Trx)途徑。

前人研究表明，AM真菌可通過調(diào)節(jié)脯氨酸代謝酶活性從而改變?nèi)~脯氨酸代謝，這對(duì)調(diào)控宿主滲透壓至關(guān)重要[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，2個(gè)編碼K+通道的基因上調(diào)AKT基因的表達(dá)，這些基因參與K+在葉部中的易位[2，24]。敏感系統(tǒng)信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)質(zhì)膜和液泡中的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)在離子穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，這涉及胞質(zhì)Ca2+信號(hào)運(yùn)輸、質(zhì)膜和液泡Na+/H+逆向調(diào)節(jié)以及H+-ATPase建立的H+梯度驅(qū)動(dòng)過程等[25]。本研究中，參與SOS途徑的相關(guān)基因發(fā)生上調(diào)，包括編碼Ca2+結(jié)合蛋白(SOS3)和CBL基因家族相互作用蛋白激酶(SOS2)的DEGs。此外，CK/SS比較中發(fā)現(xiàn)編碼V型H+轉(zhuǎn)運(yùn)三磷酸腺苷(ATP)酶的基因表達(dá)水平增加，編碼質(zhì)膜ATP酶的基因在SS/AS中也發(fā)生上調(diào)，這對(duì)于在液泡膜和質(zhì)膜上建立電化學(xué)H+梯度至關(guān)重要。這表明接種AM真菌通過在更全面、更平衡的滲透調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中調(diào)整過量Na+傳輸來促進(jìn)離子穩(wěn)態(tài)。此外，過量的Na+通常會(huì)導(dǎo)致鹽度脅迫下糖生植物中K+缺乏，因此，AKT基因的上調(diào)表達(dá)也可能在植物細(xì)胞中保持較高的K+/Na+發(fā)揮作用，從而適應(yīng)鹽脅迫[26]。

3.2 鹽脅迫下菌根共生對(duì)氮代謝相關(guān)過程的調(diào)控作用

氮(N)是限制植物生長和發(fā)育的常量營養(yǎng)素，研究表明氮吸收、運(yùn)輸、還原和同化以及氨基酸代謝等代謝過程都受到鹽度脅迫的影響[27]。就植物對(duì)鹽漬土的適應(yīng)而言，增強(qiáng)N代謝可能是AM真菌改善宿主發(fā)育的重要功能之一[17]。谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸脫氫酶(GDH)和谷氨酸合成酶(GOGAT)是參與N同化的關(guān)鍵酶[28]。在本研究中，編碼GS和GDH的DEGs在鹽度脅迫下發(fā)生下調(diào)表達(dá)；接種AM真菌后，編碼GS、GDH和GOGAT以及NRT1/PTR家族中編碼蛋白質(zhì)的DEGs表達(dá)發(fā)生上調(diào)。這表明彩葉樹雞爪槭的耐鹽性增強(qiáng)可能與接種AM真菌提高N代謝效率有關(guān)。一些研究表明，AM真菌還會(huì)導(dǎo)致編碼與次級(jí)代謝相關(guān)的酶的基因表達(dá)水平增加，例如酚類化合物、黃酮類化合物和木質(zhì)素的代謝，這些次級(jí)代謝涉及抗氧化、防御系統(tǒng)和耐鹽調(diào)控[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，455個(gè)已鑒定的DEGs在參與次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的苯丙烷、黃酮類、二苯乙烯類、二芳基庚烷類和姜酚的等生物途徑中存在顯著富集，這與前人的研究結(jié)果[29]基本一致。這些結(jié)果表明，接種AM真菌可激活氮素相關(guān)次級(jí)代謝基因從而可能在增強(qiáng)耐鹽性中起重要作用。

3.3 鹽脅迫下菌根共生可能涉及的光保護(hù)機(jī)制

光合作用是受鹽脅迫影響的主要過程之一，可能會(huì)導(dǎo)致過多的光消耗，從而導(dǎo)致光抑制甚至光損傷[30]。然而，植物已經(jīng)進(jìn)化出多種機(jī)制來保護(hù)自己免受光損傷，包括通過平衡光能的吸收和利用以及細(xì)胞環(huán)境的修復(fù)來避免光抑制[2]。本研究中，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果，在鹽脅迫下彩葉樹雞爪槭可能通過下調(diào)編碼光捕獲葉綠素a、葉綠素b結(jié)合蛋白(LHCⅡ)基因的表達(dá)水平從而降低光抑制，葉綠素是植物體中最豐富的光收集器[31]。因?yàn)長HCⅡ從PSⅡ遷移到PSⅠ的狀態(tài)轉(zhuǎn)變是由編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因(STN7)的表達(dá)水平上調(diào)啟動(dòng)的，從而平衡光系統(tǒng)之間的激發(fā)能量分布[29]。

本研究中，另一個(gè)顯著的變化是參與類胡蘿卜素代謝過程(GO：0043288)的DEGs水平發(fā)生了改變，類胡蘿卜素具有ROS清除、光保護(hù)和膜穩(wěn)定性功能，類胡蘿卜素代謝DEGs上調(diào)可有助于提高耐鹽性[32]。光反應(yīng)中，多余的光能可以從葉綠體輸出并通過線粒體呼吸鏈消散[33]，這涉及替代呼吸途徑能量守恒電子傳遞(ETC)途徑的重要旁路，該途徑涉及Ⅱ型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)脫氫酶(NDs)和抗氰化物替代氧化酶(AOX)[27-28]，從而在光保護(hù)中起著關(guān)鍵作用。本研究中，在鹽脅迫下編碼AOX的基因被下調(diào)，同時(shí)隨著接種AM真菌編碼NDB2(一種Ⅱ型NDs)的基因被上調(diào)。這些結(jié)果表明，接種AM真菌的彩葉樹雞爪槭采用多種策略來保護(hù)自己免受光損傷從而克服鹽脅迫。

綜上，本研究中，基于彩葉樹雞爪槭基因組分析總共鑒定出6 019個(gè)原始轉(zhuǎn)錄本，通過注釋到COG、GO、KEGG、KOGPfam、Swiss-Prot、egg-NOG及Nr的新基因數(shù)共得到4 672個(gè)新基因，并在鹽脅迫處理(SS)和鹽脅迫下AM真菌接種處理(AS)的比較轉(zhuǎn)錄中鑒定了455個(gè)差異基因。進(jìn)一步研究表明，在455個(gè)DEGs中，一些被鑒定為耐鹽基因，因?yàn)樗鼈儏⑴c植物細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境的改善、氮代謝相關(guān)過程和可能的光保護(hù)機(jī)制。本研究為后續(xù)研究功能分析的耐鹽候選基因提供了理論依據(jù)。