不同施硒方法對豇豆豆莢中硒形態與含量的影響

汪 園， 熊雨舟， 王世巖， 饒 申， 程 華， 熊 銀， 程水源， 李 麗，4

(1.武漢輕工大學/國家富硒農產品加工技術與研發專業中心，湖北武漢 430023； 2.武漢輕工大學生命科學與技術學院，湖北武漢 430023；3.武漢輕工大學硒科學與工程現代產業學院，湖北武漢 430023； 4.糧食作物種質創新與遺傳改良湖北省重點實驗室，湖北武漢 430023)

硒(Se)是人類和動物必需的微量營養素，它是硒酶、硒蛋白的活性中心，參與多種生理和代謝過程，具有抗氧化、免疫調節和拮抗作用，每天攝取足量的硒是維持人類健康、預防疾病和延緩衰老所必需的[1]。據估計，全球有15%的人口(5億～11億)缺乏硒，而中國約有1.05億人可能因缺硒面臨著健康隱患[2]。調查發現，與20年前生活在同一地理區域的居民相比，當前居民頭發中的硒含量下降了24%～46%[3]，有39%～61%的中國居民日硒攝入量低于世界衛生組織/聯合國糧農組織(WHO/FAO)的推薦值(26～34 μg/d)[4]。因此，在缺硒地區通過生物強化方式提高作物可食用部分硒元素的生物有效濃度，并通過它們進入食物鏈，進而改善人體缺硒狀況，是一種十分重要的策略[5]。

生長介質(如土壤)中的有效硒含量、植物對硒的吸收和積累作用對可食用植物中的硒含量起決定作用。植物積累硒的能力因植物種類而異，我國不同蔬菜可食用部位的硒含量由高到低排序為塊莖類、塊根類蔬菜>豆類>茄屬蔬菜>葉類蔬菜[4]，其中大蒜、洋蔥和豆類被認為是高富集硒的植物。豇豆[Vignaunguiculata(L.) Walp.]是豆科作物中的重要一員，栽培豇豆的類型主要包括3種，其中分布在我國的有普通豇豆(重要的食用豆類)、長豇豆(重要的豆類蔬菜)2種。豇豆富含優質蛋白質、礦物質及多酚類化合物，長期食用能夠有效提高人體抗氧化能力、增強免疫力[6-7]。由于豇豆的營養特性，對炎熱、干旱具有較好的適應性，因此在全球范圍內，尤其是拉丁美洲、亞洲和非洲等發展中國家被廣泛種植，種植面積至少達到1 200萬hm2，年產量高達350萬t。近年來，我國豇豆的年播種面積約37 萬hm2，栽培面積約占世界總面積的1/5[8]。

豇豆是一種富硒能力較強的植物，Silva等通過測定豇豆的硒含量并根據當地居民豇豆日攝入量，推測外源施入10 g/hm2硒酸鈉可提供充足的種子硒，能使人體日硒攝入量增加13～14 μg/d[9]。在我國高硒區湖北省恩施州建始縣安樂井村，天然綠色豆角中總硒含量達38.20 mg/kg，檢測到的有無機硒(SeⅥ)、硒代甲硫氨酸(SeMet)和γ-谷氨酰硒甲基半胱氨酸(γ-Glu-Se-MC)形態硒含量分別為10.04、10.64、1.48 mg/kg[10]。相關臨床試驗結果顯示，硒甲基半胱氨酸、γ-谷氨酰硒甲基半胱氨酸具有較好的抗癌效果，其中硒代甲硫氨酸是被授權許可的作為食品強化劑的硒化合物[10]。此外，植物硒生物強化不僅能生產富硒食物，還能誘發產生更多的次生代謝物，可能更利于人類健康[5]。由此可見，富硒豆類植物作為功能性補硒食品具有很好的開發利用價值。

目前關于豇豆的研究主要集中在通過栽培措施調控其生長、營養品質和產量等方面[11-12]，關于豇豆富硒栽培及該過程中硒的積累、轉化的研究少有報道。由此，本研究主要以亞硒酸鈉、納米硒為硒源，以2個不同生長習性的長豇豆品種——有架豇豆與矮蔓豇豆為試驗材料，研究不同外源硒形態、不同施用濃度、不同采收時間和施硒次數對豆莢中硒形態、硒含量的影響，以期為闡明豇豆對硒的富集轉運特性、生產安全可靠的富硒豇豆提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設置

本試驗所選材料為長江中下游地區廣泛種植的2個不同生長習性的長豇豆品種：之豇28/2(有架型)和美國無架豆(矮蔓型)，購買于荊州市農資大市場，試驗地點位于武漢輕工大學基地種植圃內(土壤類型為壤土)。針對不同研究目的，分別于2020年4—9月開展2個不同階段的豇豆富硒栽培試驗，為避免相互干擾，2次試驗在不同種植區域進行。

于2020年3月下旬至6月中旬進行2個豇豆品種不同硒源、不同硒濃度處理的試驗。3月31日播種，6月3日于初花期以葉面噴施的方式進行外源硒處理。施入的硒源分別為生物納米硒(SeNPs)、亞硒酸鈉(Na2SeO3)，納米硒由湖北省農業科學院提供，亞硒酸鈉購買于湖北成豐化工有限公司；硒濃度梯度均設為0、0.1、0.5、1.0、2.5、3.0 mmol/L。試驗采用隨機區組設計，每組設6株植株，共3次重復。生長期間進行正常的水肥及病蟲害防治管理，2020年6月11日收獲豆莢，將其干燥、研磨成粉狀、過篩后備用。

2020年7月下旬至9月下旬進行2個豇豆品種不同采收時間及施硒次數的處理試驗。7月27日播種，(1)于豇豆初花期(8月29日)施1次肥，分別于9月8日、9月25日進行采樣；(2)于結莢期(9月17 日)進行第2次施肥，統一于9月25日采樣。根據不同采收時間分為第1茬(9月8日)、第2茬(9月25日)；根據生長期間施入硒肥次數的不同，分為施1次肥(僅初花期施1次)、施2次肥(初花期、結莢期各施1次)。外源硒采用葉面噴施方式，所用硒源為納米硒、亞硒酸鈉，施入濃度均分別為0(對照)、0.5 (低)、2.5 mmol/L(高)。試驗采用隨機區組設計，每組設6株，共3次重復。在豇豆生長期間進行正常水肥及病蟲害防治管理。采樣后將其干燥、研磨成粉狀、過篩后備用。

1.2 檢測豇豆豆莢中的硒含量和硒形態

1.2.1 總硒含量測定 主要參考Rao等的方法[13]，用Multiwave PRO[安東帕(上海)商貿有限公司]對樣品進行消解，用10%鹽酸定容后，使用原子熒光光譜儀(AFS8530，北京海光儀器有限公司)測定吸光度，根據標準曲線計算樣品溶液中的硒含量。

1.2.2 硒形態檢測 主要參考Rao等的方法[13]，各種硒標準品購自國家標準物質資源共享平臺，包括SeCys2、MeSeCys、SeMet、亞硒酸鈉與硒酸鈉5種硒形態標準品，并繪制標準曲線。將使用蛋白酶E、蛋白酶K消化后的待測樣品溶液注入液相色譜-原子熒光聯用儀(LC-AFS8530，北京海光儀器有限公司)中，測定各種硒形態的峰面積，將峰面積代入混標標準曲線中，計算各樣品中不同形態硒的含量。

1.3 數據處理

用Excel 2010、Origin進行數據處理和作圖，用DPS軟件中的Duncan’s新復極差法進行不同處理組內及組間均值的差異顯著性比較，結果為“平均值±標準誤”，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 不同濃度外源硒處理對豇豆總硒含量的影響

從圖1可以看出，隨著施入外源硒濃度的升高，2個不同豇豆品種豆莢中累積的硒含量均有明顯提高。與對照組相比，0.1～3.0 mmol/L SeNPs處理組有架豇豆豆莢中的硒含量分別提高了75.46%、265.75%、399.91%、1 220.32%、1 182.14%，以2.5 mmol/L SeNPs處理的硒含量最高，為 11.53 μg/g；與2.5 mmol/L SeNPs處理相比，3.0 mmol/L SeNPs處理豆莢中的總硒含量略有下降，但不顯著；有架豇豆在施入Na2SeO3后總硒含量的表現與施入SeNPs相似，但在相同濃度下Na2SeO3對豆莢中硒含量的提升效果更為明顯，當Na2SeO3濃度>2.5 mmol/L后，豆莢硒的積累量大幅增加，在3.0 mmol/L濃度處理下達到最大值18.75 μg/g(圖1-a)。

在對照組中，矮蔓豇豆中的硒含量比有架豇豆高，前者是后者的2.30倍。0.1～1.0 mmol/L SeNPs對矮蔓豇豆豆莢中硒含量的提升效果無顯著差異，當SeNPs濃度>1.0 mmol/L時，豆莢中的硒含量顯著增加，當SeNPs濃度為3.0 mmol/L時達到最大值12.81 μg/g。如圖1-b所示，在低濃度Na2SeO3(<0.5 mmol/L)處理下，Na2SeO3對矮蔓豇豆豆莢中硒含量的增加效果不如SeNPs；當外源硒濃度>1.0 mmol/L時，Na2SeO3的作用更為明顯。相比于對照，施入0.5～3.0 mmol/L Na2SeO3后，矮蔓豇豆豆莢中的硒積累量得到顯著提高，分別增加了1.11、3.22、4.47、8.00倍，且各處理組間差異顯著。

2.2 不同濃度外源硒處理對有架豇豆硒形態的影響

不同外施硒源種類與施入量對有架豇豆豆莢中累積硒的存在形態與含量均有較大影響(表1、圖2)。在對照處理中，有架豇豆豆莢中有SeCys2、Se4+2種形態的硒，含量占比分別為88.81%、11.19%。而在用2種外源硒處理后，豆莢中的硒形態均以MeSeCys、SeMet為主，含量占比分別為15.20%～36.53%、63.47%～74.64%(表1)。其中，SeNPs處理的有架豇豆豆莢中的硒均以有機硒形態存在，用Na2SeO3處理時，僅在高濃度下(≥2.5 mmol/L)檢測到無機形態的硒(Se4+)。

由表1可知，當施入的SeNPs濃度為0.1～2.5 mmol/L 時，從有架豇豆豆莢中檢測到MeSeCys、SeMet 2種硒形態，其含量分別為0.118 3～0.293 5、0.325 4～0.705 2 μg/g；當SeNPs濃度為3.0 mmol/L時，檢測到SeCys2、MeSeCys、SeMet 3種形態的硒，其含量占比分別7.85%、21.19%、70.96%。豆莢中MeSeCys的含量隨著SeNPs施入濃度的增加呈先增后減的趨勢，在0.5～3.0 mmol/L處理組間無顯著差異，而SeMet含量整體呈逐漸增加的趨勢。

表1 2種硒源處理后有架豇豆豆莢硒形態的含量與每種硒形態含量占比情況

Na2SeO3與SeNPs處理后硒積累的情況相似。當施入的Na2SeO3濃度為0.1～1.0 mmol/L時，從有架豇豆豆莢中僅檢測到MeSeCys、SeMet，其含量分別為0.241 6～0.290 1、0.419 8～0.704 0 μg/g；當Na2SeO3濃度升高至2.5 mmol/L時，新增檢測到Se4+；當Na2SeO3濃度升高至3.0 mmol/L時，新增檢測到SeCys2，此時SeCys2、MeSeCys、SeMet、Se4+的含量占比分別為9.17%、15.20%、74.64%、0.99%。與SeNPs處理相似，MeSeCys的含量在Na2SeO3濃度為0.1～3.0 mmol/L時呈先增后減的趨勢，處理組之間差異不顯著，而SeMet含量整體呈逐漸增加的趨勢。

2.3 不同濃度外源硒處理對矮蔓豇豆硒形態的影響

施加外源硒對矮蔓豇豆豆莢中硒積累的影響與對有架豇豆不同。在所有處理中，有架豇豆豆莢中硒的存在形態均以SeMet為主，其占比為55.00%～100.00%。當SeNPs、Na2SeO3的處理濃度為0～0.1 mmol/L時，豆莢中均只檢測到唯一的硒形態——SeMet；隨著外源硒施入濃度的提高，檢測到的硒形態種類逐漸增加。且外源硒濃度≤2.5 mmol/L 時均以有機硒形式存在；當外源硒濃度為3.0 mmol/L時，可檢測到無機態硒離子(Se4+、Se6+)(表2)。

當施入的SeNPs濃度為0.5 mmol/L時，矮蔓豇豆豆莢中的硒形態為MeSeCys、SeMet，其占比分別為28.65%、71.35%；當SeNPs濃度為1.0、2.5 mmol/L 時，硒形態有SeCys2、MeSeCys、SeMet，占比分別為2.17%、26.93%、70.90%和4.45%、32.31%、63.24%；當SeNPs濃度為3.0 mmol/L時，檢測到Se4+、Se6+、SeCys2、MeSeCys、SeMet 5種形態的硒，其中無機硒占比為13.88%，有機硒占比為86.12%。從表2可以看出，從矮蔓豇豆豆莢中檢測到的各種形態硒的含量隨著施入的SeNPs濃度增加呈遞增趨勢，且各處理間差異顯著。

與SeNPs處理不同的是，用0.5 mmol/L Na2SeO3處理后可檢測到SeCys2、MeSeCys、SeMet等3種有機硒的存在形態，其占比分別為1.21%、14.82%、83.97%；隨Na2SeO3濃度升高至 3.0 mmol/L，可檢測到Se4+、SeCys2、MeSeCys、SeMet 4種形態的硒，其占比分別為3.12%、6.28%、18.61%、71.99%。同樣的，矮蔓豇豆豆莢中檢測到的各種硒形態的含量隨施入的Na2SeO3濃度的增加呈逐漸升高的趨勢(表2)。

2.4 不同采摘時間對豇豆豆莢總硒含量的影響

在硒源相同、處理濃度相同的情況下，不同采摘時間對2種豇豆豆莢中總硒含量有較大影響。其中有架豇豆在用Na2SeO3處理后，第2茬采樣時豆莢中的總硒含量與第1茬相比均有所下降，但差異不顯著；而用SeNPs處理后，低濃度(0.5 mmol/L)處理組中第2茬采樣的豆莢中總硒含量比第1茬顯著增加，而高濃度(2.5 mmol/L)處理組中第2茬采樣的豆莢中總硒含量與第1茬采樣時相比顯著下降(圖2-a)。

不同采摘時間對矮蔓豇豆豆莢中總硒含量的影響與對有架豇豆中總硒含量的影響不同。用Na2SeO3、SeNPs 2種硒源處理后，低濃度(0.5 mmol/L)處理組中第2茬采樣的豆莢中總硒含量與第1茬采樣相比都略有降低，而高濃度(2.5 mmol/L)處理組中第2茬采樣的豆莢中總硒含量與第1茬采樣相比則有所提高。其中2.5 mmol/L SeNPs處理組中，與第1茬相比，第2茬采樣的豆莢中硒含量顯著升高，約升高了1.16倍(圖2-b)。

2.5 不同施硒次數對豇豆豆莢總硒含量的影響

從圖3可以看出，不同施硒次數也對豇豆總硒含量有影響，且用不同形態硒源處理后的效果不同。用SeNPs處理時，有架豇豆豆莢中的總硒含量隨著施硒次數的增加而顯著升高，在高濃度(2.5 mmol/L)處理組中，施肥2次后豆莢中的總硒含量約為施肥1次的5.23倍；用Na2SeO3處理時，在低濃度(0.5 mmol/L)處理組中，與施肥1次相比，施肥2次的豆莢中總硒含量顯著增加，而在高濃度(2.5 mmol/L)處理組中，施肥2次后總硒含量反而下降，但與施肥1次相比沒有顯著差異(圖3-a)。

施硒次數對矮蔓豇豆豆莢中總硒含量的影響與有架豇豆相似。用不同濃度SeNPs處理后，與僅施肥1次相比，施肥2次后矮蔓豇豆豆莢的總硒含量均有所增加，其中在低濃度(0.5 mmol/L)處理下，增施效果顯著，約提高了2.05倍。而用Na2SeO3在增施1次后，對豇豆豆莢中硒含量的影響與SeNPs不同。在低濃度(0.5 mmol/L)Na2SeO3處理組中，與施肥1次相比，施肥2次的豆莢中總硒含量略有增加，而在高濃度(2.5 mmol/L)處理組中，施肥2次后豆莢中的總硒含量顯著下降(圖3-b)。

3 討論與結論

根據WHO/FAO的建議[14]，人體每天需要攝入的硒劑量為55 μg/d，耐受極限為400 μg/d。我國是世界上缺硒程度比較嚴重的國家之一，大部分人的硒攝入量不足，因此我國早在20世紀90年代便開始采用硒生物強化策略，經過努力，目前居民缺硒狀況已有一定的改善。膳食硒攝入量直接與膳食結構和作物硒生物強化的效果有關。根據《中國統計年鑒(2013—2019年)》，我國居民對谷物類的人均消費量呈逐年下降的趨勢，而對豆類、蔬菜類食品的消費量卻大幅上升。以往生物硒強化主要集中在水稻、小麥等禾谷類作物，有必要圍繞豆類或蔬菜開展相關研究和探索。豇豆是我國重要的常規蔬菜種類之一，栽培范圍很廣。豇豆鮮豆莢含有豐富的營養，如較高含量的蛋白質、糖類和膳食纖維，以及胡蘿卜素、維生素B和維生素C等[15]，可鮮食、腌制，或加工成飼料；富硒豇豆可作為綠色功能性食物進行開發，但目前相關報道并不多。

施入外源硒(SeNPs或Na2SeO3)后，豇豆豆莢中對總硒的吸收和累積均表現出量效關系(dose-response relationship)，這與在其他豆科植物如豌豆[16]、紫云英[17]、普通豇豆[9]、苜蓿[18]上的研究結果一致。研究發現，葉面噴施37.5～750.0 mg/L Na2SeO3能有效提高豌豆苗中的大分子結合硒和總硒含量，與對照相比分別提高8.75～38.75、6.01～55.65倍[19]。在本研究中，與對照處理相比，SeNPs、Na2SeO3在最高施用濃度(3.0 mmol/L)下，能使有架豇豆豆莢中的硒含量分別提高 1 182.14%、2 047.27%；能使矮蔓豇豆豆莢中的硒含量分別提高538.60%、800.76%。總體來看，SeNPs對豇豆豆莢中硒含量的增加效果不如Na2SeO3，這可能與它們的吸收動力學、不同的理化性狀以及與生物分子的相互作用不同有關[20]。Na2SeO3的內流機制與SeNPs不同，主要由于Na2SeO3進入植物體是通過磷酸鹽轉運體的主動轉運，而SeNP則是通過水通道蛋白的被動擴散。在小麥和水稻中[20-21]，SeNPs的吸收速率遠低于Na2SeO3。此外，本研究中使用的SeNPs是由復雜的微生物群落合成的，封端劑(即蛋白質、多糖、酚類、胺類和醇類)存在于SeNPs的表面，這種胞外聚合物質的存在可能是影響它們在豇豆中運輸和積累的不利因素之一[20]。值得注意的是，施用 3.0 mmol/L Na2SeO3對豇豆植株有毒害作用，表現為葉緣處分布大量不規則的壞死點和葉脈間褪綠，推測可能是由于高濃度Na2SeO3的葉噴處理使豇豆葉肉細胞中形成活性氧(ROS)，導致細胞膜結構破壞、葉綠素濃度下降[22]。然而，相同濃度SeNPs的應用卻并未使豇豆植株表現出明顯的受害癥狀，這一現象表明，SeNPs的植物毒性低于亞硒酸鹽，與Li等在大蒜不同形態硒源的水培試驗中觀察到的結果[23]一致。

對于種植1次后可多次收獲的植物，研究其再生組織中硒的積累和轉運，可為制定平衡的硒強化方法提供有用信息。Zoltán等對同一生長季節4次收獲的紫花苜蓿的硒吸收和積累動態進行了監測，發現在硒酸鹽和亞硒酸鹽處理組中，莖、葉組織中的硒含量在收獲期間呈逐漸下降的趨勢，納米硒處理的效果與此不同[18]。在10 mg/L納米硒處理組中，豇豆葉片中的總硒含量除2.5mmol/L Na2SeO3處理短蔓豇豆外在第1次收獲(14.3 μg/g)到第4次收獲(37.5 μg/g)間逐漸增加，在50 mg/L納米硒處理組中，前1～3次收獲的總硒含量有所下降，第4次收獲時又有所上升。在本研究中，2個不同的豇豆品種在Na2SeO3處理下的表現與苜蓿相似，第2茬采收的豆莢中的總硒含量除2.5 mmol/L Na2SeO3處理短蔓豇豆外均較第1茬采收的低，但差異不顯著。而在用SeNPs處理后，2個不同品種表現有所不同：與第1茬相比，有架豇豆在低濃度(0.5 mmol/L)下、矮蔓豇豆在高濃度(2.5 mmol/L)下，第2茬采收的豆莢中累積的硒含量均顯著上升，另外2種情況與此相反。Zoltán等認為，紅色納米硒與緩釋肥料有相似的效果[18]。從本研究結果看，該論斷有待商榷，很可能因植物基因型不同，納米硒在植物細胞內發生氧化還原、同化代謝及轉運方式的不同而有差異。

本研究表明，通過葉面噴施納米硒與亞硒酸鈉能夠有效提高豇豆豆莢的總硒含量。豆莢中的硒形態以SeMet和MeSeCys為主，因外源硒種類、施用濃度、植物基因型的不同累積的硒形態及含量有所不同。綜合豇豆對硒吸收和積累的動態變化，考慮到外源施用的納米硒比亞硒酸鹽對植物及環境更為友好的特點，以及食物中有機硒具有更高的生物利用率和安全性、更好的功效等優點，從硒生物強化的角度，采用2.5 mmol/L SeNPs在豇豆初花期進行葉噴(如有必要可在結莢期追施1次)是最佳處理。