蛋雞資源群體的小腸質量全基因組關聯分析

李永峰， 王克華， 竇套存， 胡玉萍， 郭 軍， 王星果， 馬 猛， 曲 亮

(江蘇省家禽科學研究所，江蘇揚州 225125)

飼料成本是蛋雞飼養成本主要組成部分，通過提高飼料效率可有效降低飼養成本，優化飼料配方是提高飼料效率的重要手段。然而，隨著生物技術的發展，基因選擇成為一種更有效的方法[1]。腸道發育是家禽飼料效率的重要影響因素之一，與消化酶的活性和營養吸收能力息息相關[2]。腸道質量是反映腸道發育的重要指標。目前，關于雞小腸質量遺傳背景的研究很少，有必要對其遺傳結構進行解析。GWAS通過對全基因組中的序列變異、表型和系譜信息進行關聯分析，從而篩選出目標性狀的調控基因或元件[3]。與傳統QTL定位作圖方法相比，GWAS檢測變異的效果更好，定位的基因組區域更窄[4]。在雞的形態特征、生產性狀、抗病等方面已有許多GWAS研究成果[3]，但與雞小腸質量有關的GWAS研究鮮有報道。本研究選取F2代資源群體母雞1 512羽，采用600K雞SNP芯片進行基因型檢測和GWAS分析，以期為蛋雞小腸質量性狀的遺傳機制解析提供參考，為分子育種提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 資源群體構建

由白來航(WL)純系和東鄉綠殼蛋雞(DX)純系雜交生產F2代資源群體，由圖1可知，最終獲得F2代個體母雞1 893羽，從中選擇1 534羽用于SNP基因型檢測。試驗時間為2012—2014年，試驗地點為江蘇省家禽科學研究所揚州翔龍禽業有限公司。

1.2 表型測定

屠宰72周齡F2代雞，收集十二指腸、空腸和回腸，擠壓出內容物后稱質量記錄。使用SAS進行描述性統計分析，所有數據經正態轉換后用于GWAS和遺傳估計等下游分析。

1.3 基因分型、質量控制

雞翅靜脈采血收集F2代母雞血液，血液DNA使用苯酚/氯仿萃取法抽提，選用600K Affymetrix Axiom雞高密度基因芯片進行基因型檢測，通過Affymetrix工具v1.16.0軟件執行質量控制(QC)，保留QC≥0.82樣品，獲得有效樣本1 512個，有效SNP 532 299個。本統計方法對表型和性染色體基因型的關聯檢測低于常染色體，因此刪除性染色體上所有SNP。使用PLINK v1.90軟件包做進一步質量控制[5]，剔除次等位基因頻率<0.05、偏離哈迪溫伯格檢驗(P<10-6)的SNP。基因型填充分析由BEAGLE v4.0[6]程序執行，保留質量分數(R2>0.5)的SNP，最終獲得1 512羽個體和435 867個SNP。

1.4 全基因組關聯分析

為消除虛假關聯，首先使用PLINK軟件包進行主成分分析。利用simpleM[7]法計算全基因組顯著性和潛在性關聯的閾值。有效獨立測試值為 59 308，因此全基因組顯著性P值為8.43×10-7(0.05/59 308)，潛在性P值為1.69×10-5(1.00/59 308)。使用GEMMA v0.94軟件[8]中的單變量混合模型對小腸質量性狀進行GWAS，模型公式如下：

y=wα+xβ+μ+ε；

其中：y是n個個體的n×1表型值向量；w為固定效應，是n×c協變量矩陣，包括列向量1；α是c×1相應系數向量，包括截距；x是測試位點的n×1標記基因型向量；β表示每個標記中次等位基因的效應，是標記的效應大小；μ是n×1隨機效應向量，協方差結構為μ-N(0，KVg)，其中K表示n×n遺傳相關矩陣，來源于SNP標記，Vg是多基因加性方差；ε是ε～N(0，IVe)的n×1隨機殘差的向量，I是n×n單位矩陣，Ve是殘差方差分量。

使用R軟件GAP包繪制曼哈頓和quantile-quantile(QQ)圖，GenABEL包中的estlambda函數計算基因組膨脹因素λ(表示假陽性信號程度)[9]。

1.5 遺傳力估計及對表型方差貢獻率

使用REML法估計遺傳力，由GCTA v1.24程序執行[10]。使用二元混合模型估計各部分腸質量遺傳和表型相關[11]。估計全基因組顯著SNP、表型方差貢獻的混合線性模型如下：

其中，y是表型向量；x是解釋表型固定效應的關聯矩陣；b是固定效應向量；zj是基因型協變量SNPj(AA=-10，AB=0，BB=+10)；αj是SNPj的等位基因替代效應；δj是參數，表示SNPj是否包含在馬爾可夫鏈蒙特卡羅(MCMC)鏈；ε是與分析相關的誤差。

1.6 基因鑒定

使用Biomart工具(基于Ensembl支持的Galgal4組件)和變異效應預測軟件VEP鑒定顯著位點的候選基因[12]，并檢測給定基因組區域中的基因[13]。

2 結果與分析

2.1 表型和遺傳參數

表1為十二指腸質量(DW)、空腸質量(JW)、回腸質量(IW)描述性統計結果。共測量 1 508 羽母雞，獲得十二指腸1 435個、空腸1 436個、回腸 1 434 個有效數據。3個性狀的變異系數均較大，這可能是由于F2代資源群體的個體差異較大。

表1 F2代雞小腸質量的描述性統計

通過合格的GWAS標記對計算DW、JW、IW的加性遺傳方差，并統計遺傳參數。由表2可知，單變量GCTA分析顯示，3種腸道質量性狀遺傳力在中等水平，DW的遺傳力估計值最高，為0.32。雙變量GCTA分析表明，3種腸道質量性狀表現出較高的遺傳相關，JW與IW的遺傳相關最高，為0.88。表型分析表明，3種小腸質量也具有中等程度表型相關。

表2 小腸質量遺傳參數

2.2 候選位點GWAS鑒定

對3種小腸質量分別進行單變量全基因組關聯分析，結果由表3、圖2可知，分別有185、201、36個全基因組顯著SNP位點與DW、JW、IW關聯(共422個)。幾乎所有的顯著位點均位于1號染色體的166.6～173.2 Mb基因組區域，僅有1個顯著SNP位點位于4號染色體的49.9 Mb基因組區域。由圖2可知，共有28個顯著SNP位點與3種小腸質量性狀均顯著相關。根據所有影響DW、JW、IW的SNP的P值制作曼哈頓圖和QQ圖(圖3)。

表3 顯著SNP位點數量和分布

2.3 顯著位點的基因注釋

基因內部的SNP比基因間區域的更重要。由表4可知，通過VEP和Biomart對3種小腸質量性狀均顯著的28個SNP周圍區域進行掃描，鑒定與3種小腸質量相關的基因，發現有6個SNP位于4個基因的內含子區。rs313669574和rs313152047對應基因FOXO1，rs315029039對應基因CKAP2，rs313765223對應基因CAB39L，rs312737959和rs13972990對應基因MRPS31。將這6個SNP位點和4個基因作為候選位點和基因。

2.4 估計表型方差貢獻率(CPV)

對上述6個SNP位點進行CPV計算，由表4可知，位點rs313669574、rs313152047、rs315029039、rs313765223、rs312737959和rs13972990可分別解釋小腸質量表型方差的2.92%～3.26%、2.84%～4.80%、3.23%～3.71%、3.29%～5.33%、3.26%～4.99% 和3.29%～4.85%。

3 討論

腸道作為重要的消化器官，其發育對動物的生長發育和生產性能有重要影響，有必要對腸道質量基因組結構進行。GWAS是研究動物遺傳結構特點的有效手段，廣泛應用于多種畜禽，如豬[14-15]、牛[16-17]和家禽[18-19]。因此，本研究對1 512羽F2代蛋雞資源群體小腸質量進行GWAS分析，擴大性狀差異化水平，提高差異性狀QTL識別能力，并使用高密度SNP芯片覆蓋雞所有的染色體，從而提高結果的準確性和可靠性。

描述性統計結果可知，小腸質量的變異系數很大， 提示個體間性狀差異化水平很高。遺傳評估的結果表明，DW、JW、IW均具有中等遺傳力。性狀相關的分析結果表明，3個小腸質量性狀具有較高的遺傳相關性，但表型相關均處于中等水平，說明環境因素對小腸質量性狀的影響較大。這與Li等關于小腸長度的研究結果[20]相似，二者的遺傳特征相似。

GWAS的結果表明，DW、JW、IW的422個顯著SNP位點中，有421個位于1號染色體的166.6～173.2 Mb區域，表明3個小腸質量的遺傳控制高度集中。這與我們在小腸長度的研究結果相似，顯著SNP位點集中在1號染色體的170 Mb區域[20]，表明腸道發育的遺傳控制主要集中在1號染色體的170 Mb附近區域。

通過對DW、JW、IW均顯著的28個SNP進行分析研究，有6個SNP(rs313669574、rs313152047、rs315029039、rs313765223、rs312737959和rs13972990)和對應的4個基因(FOXO1、CKAP2、CAB39L和MRPS31)被列為最重要的SNP位點和基因，因為這6個SNP位于相應基因的內含子區。Forkhead轉錄因子FOXO1(forkhead box O1)可能在肌源性生長和分化中起作用，是調節胰島素靶組織中葡萄糖代謝和胰島素反應的關鍵轉錄因子[21-22]。研究表明口服胰島素可刺激IUGR仔豬小腸絨毛的生長和黏膜功能的成熟[23-24]，因此推測它在小腸發育中可能通過調節胰島素起作用。CKAP2(cytoskeleton associated protein 2)是細胞骨架相關蛋白2，參與細胞的有絲分裂過程[25]。研究表明，CKAP2在視網膜微血管內皮細胞[26]和肝癌細胞[27]的增殖、遷移中發揮作用，并與卵泡發育和選擇關系密切[28]，推測其可能與多器官的發育有關。CAB39L(calcium binding protein 39 like)作為MO25家族成員，編碼鈣結合蛋白39樣。研究表明CAB39L能夠通過AMPK途徑調節食物的攝入[29-30]，且雞體內也存在與哺乳動物相似的AMPK途徑[31]。腸道發育也與動物的采食量有關，但其與CAB39L的關系還有待進一步研究。MRPS31(mitochondrial ribosomal protein S31)是線粒體核糖體蛋白S31，參與線粒體中蛋白質的合成，在各種生命活動中都起重要作用。綜上所述，這4個基因可能與小腸重量高度相關，而其對應的6個SNP的CPV均較高，進一步說明它們可能是影響雞小腸質量的重要候選基因。

表4 小腸質量性狀全基因組關聯分析

4 結論

通過GWAS共鑒定出28個與DW、JW、IW均顯著相關的SNP，全部集中在1號染色體的166.6～173.2 Mb區域，其中6個SNP位于相應4個基因的內含子區，這些位點和基因可能是影響小腸質量的重要SNP位點和基因。