新疆部分地區牛源無乳鏈球菌主要毒力基因和耐藥基因的檢測與序列分析

陳 杰， 魏 勇， 王晨豫， 曹夢園， 陳明杰， 閆雪琪， 齊亞銀

(1.石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000； 2.新疆天澳牧業有限公司，新疆奎屯 833200)

奶牛乳房炎是奶牛的常見多發病，由于其病因復雜多樣、病原種類繁多、易反復發作等特點，目前，已成為奶牛養殖中造成經濟損失最嚴重的疾病[1]。無乳鏈球菌更是引起奶牛乳房炎最重要的病原菌之一，常存在于奶牛的皮膚、乳頭及乳房內，并通過擠乳人員手或擠乳機械及蠅類的攜帶而傳播。無乳鏈球菌引起乳房炎后不產生明顯免疫力，目前暫無可靠的多價菌苗[2]。無乳鏈球菌屬革蘭氏陽性菌，會對人類和動物造成嚴重的侵入性感染。無乳鏈球菌不僅可引起人類腦膜炎、肺炎、新生兒敗血癥等，也會引起豬、牛、魚等動物的鏈球菌病，這主要是由于該菌具有多種毒力因子，使其能夠在宿主中定殖，逃避宿主吞噬從而大量繁殖[3]，具有較高的致病性和致死性。

現階段采用抗生素治療仍是最普遍治療奶牛乳房炎的方法，大量且多種類的抗生素，在臨床治療奶牛乳房炎時被廣泛應用。抗生素的療效與抗生素本身的性質、到達乳房的有效濃度、用藥次數及給藥時間等有關[1]。在抗生素治療奶牛乳房炎的過程中，諸多不利因素也逐漸呈現，易出現抗藥性和耐藥性；引發其他一些副作用，如腸道菌群失調、影響食欲等；造成牛奶中藥物殘留及奶牛體內藥物積蓄等[4]。此外，無乳鏈球菌中存在許多毒力因子，這些毒力因子可黏附聚集在乳腺上皮細胞上，通過破壞乳腺細胞的酶系統來打破乳腺細胞的蛋白平衡，這些毒力因子的免疫調節作用不僅與致病機制具有一定的關系，而且還決定著無乳鏈球菌的感染方式[5]。

為更加全面地了解新疆部分地區無乳鏈球菌的生物學特性，本研究采用實驗室傳統的細菌學鑒定方法與分子生物學技術相結合的方式，對新疆部分地區規模化奶牛場2021年7—8月所采集目標牛乳樣中的無乳鏈球菌進行分離鑒定。并對目標菌株進行生化鑒定、藥物敏感性測定、分子生物學鑒定、耐藥基因及毒力基因檢測等一系列工作。從而為新疆部分地區的規模化奶牛場中由于無乳鏈球菌所引發的一系列疾病，提供合理的防治方案、檢測方法，為日后研究無乳鏈球菌致病性及流行病學調查、疫苗的研制提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品 試驗樣品均采自新疆石河子、奎屯地區規模化奶牛場共計147份體細胞數≥300 萬個/mL的奶樣，-4 ℃運輸保存。

1.1.2 主要試劑及藥品 試驗所需相關試劑見表1。

表1 實驗試劑

1.1.3 主要儀器與設備 試驗所需相關儀器與設備見表2。

1.2 樣品采集

2021年7—8月在新疆石河子、奎屯地區飼養規模均為1 200頭左右的2個規模化奶牛場，在進行奶樣采集工作時，首先根據奶牛場最近存檔的DHI數據中SCC(體細胞數)≥300 萬個/mL的泌乳牛信息，并通過奶牛場“阿菲金”軟件系統，快速、準確的鎖定體細胞數 ≥300 萬個/mL目標牛， 從而準確篩選出SCC≥300萬個/mL目標牛的乳樣，確保樣品的正確性。再通過牛博士體細胞檢測儀的聯合使用，對SCC≥300 萬個/mL的奶樣進行二次確診，7—8月牛場SCC≥300 萬個/mL奶牛頭數共計134份。其次，對均處于泌乳期的已確診為臨床型乳房炎成年奶牛進行樣品采集(所選牛均未投喂含有抗生素的飼草料并且沒有參與獸醫治療)，共采集13份臨床型乳房炎牛奶樣。采用 5 mL 無菌EP管采集，擠奶時選擇已完成前藥浴、棄頭3把奶工作后的奶樣，共采集147份奶樣， -4 ℃ 運輸保存。

表2 儀器與設備

1.3 無乳鏈球菌的分離純化與保藏

1.3.1 分離純化 將奶樣樣品管充分渦旋振蕩均質，移取50 μL，轉種于800 μL疊氮鈉葡萄糖肉湯培養基內，在振蕩培養箱中37 ℃、180 r/min培養 18～24 h。在脫纖維綿羊血瓊脂培養基上劃線接種，在37 ℃恒溫培養箱中培養18～24 h。挑取具有β溶血環的單個菌落重復轉種于疊氮鈉葡萄糖肉湯培養基中振蕩培養18～24 h。再次在脫纖維綿羊血瓊脂培養基上劃線接種，在37 ℃恒溫培養箱中培養18～24 h。挑取具有β溶血環的單個菌落進行涂片、革蘭氏染色，于顯微鏡下鏡檢觀察，將鏡檢呈革蘭氏陽性球菌、鏈狀排布的單個菌落再次轉種于腦心浸出液肉湯(BHI)培養基振蕩培養18～24 h。

1.3.2 菌種的保藏 首先將丙三醇(甘油)與蒸餾水1 ∶1混勻在錐形瓶中，使得甘油濃度保持在50%，再通過高壓滅菌鍋121 ℃條件下高壓20 min。再將經多次分離純化后的無乳鏈球菌的菌液與50%甘油，按照1 ∶1比例各取500 μL加入無菌凍存管中混勻，最后置于-20 ℃冰箱儲存。

1.4 分離菌形態學觀察

使用接種環分別將純化后的鏈球菌屬菌液均勻涂抹在載玻片中央，將載玻片置于乙醇燈外焰上3～5 cm處固定，經革蘭染色法染色后，在光學顯微鏡的100倍油鏡下觀察菌株形態。

1.5 生化反應

參照鏈球菌生化鑒定手冊，吸取10 μL純化后的無乳鏈球菌菌液，分別依次接種至V-P、PYR、精氨酸、DPP、PMG、七葉苷、MAG、TMZ、蕈糖、蔗糖、山梨醇生化鑒定管中，置于34 ℃恒溫培養箱中培養36～48 h后觀察結果。

1.6 CAMP法檢測

無乳鏈球菌能夠產生CAMP因子，該因子可與紅細胞反應產生溶血現象，而金黃色葡萄球菌中的β毒素能夠增強這種溶血程度。因此，在這2種細菌的交界處溶血現象會大大増強，出現箭頭型透明溶血區。具體操作方法為：使用無菌接種環，先以溶血性金黃色葡萄球菌劃一橫線接種在5%脫纖維綿羊血瓊脂平板上，再將待檢菌與前一劃線作垂直接種，兩者應相距1cm，于37 ℃培育18～24 h后觀察結果，每次試驗應做陰、陽性對照。2種細菌劃線交接處出現箭頭型溶血區為陽性。

1.7 分子生物學鑒定

依照DNA提取試劑盒操作步驟提取鏈球菌屬DNA，于-20 ℃保存。對提取的分離菌DNA進行PCR擴增，引物合成參考文獻[6-7]，引物序列及條件見表3，反應體系為25.0 μL：2×TaqPlus Master mix Ⅱ 12.5 μL，雙蒸水6.5 μL，上下游引物各1.0 μL，細菌DNA模板4.0 μL。反應程序為：①95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火 1 min，72 ℃延伸2 min，進行30個循環；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。②94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，進行30個循環；72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存。

擴增PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條件為：0.5×TBE電泳液，120 V，90 mA，45 min。采用凝膠成像儀對電泳后的瓊脂糖凝膠進行分析。無乳鏈球菌目的基因預期擴增片段約345 bp、乳房鏈球菌目的基因預期擴增片段約330 bp。將擴增產物送至睿博興科生物技術有限公司測序，并在NCBI上對序列進行在線比對。

表3 PCR擴增條件及引物序列

1.8 無乳鏈球菌藥物敏感性試驗

根據CLSI推薦的藥敏紙片擴散法(K-B法)選取β-內酰胺類(青霉素、氨芐西林、阿莫西林)；氨基糖苷類(鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、新霉素)；喹諾酮類(恩諾沙星、諾氟沙星、環丙沙星)；頭孢類(頭孢氨芐、頭孢噻肟)；糖肽類(萬古霉素)；四環素類(四環素)；林可霉素類(克林霉素)測定各分離株對15種抗生素的敏感性。藥敏紙片，均購自杭州濱和微生物試劑有限公司。將多次分離純化后得到的無乳鏈球菌，接種與BHI肉湯培養基中，置于恒溫搖床內增菌培養24 h后，采用生理鹽水將菌液濃度調節至(1～2)×10 CFU/mL。按照紙片法的操作，吸取適量菌液涂布在LB瓊脂平板上，取出不同藥敏紙片，貼于瓊脂表面，不同藥敏紙片的間距至少24 mm。將平板置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后，測量瓊脂上的抑菌環直徑。評判結果均參照美國臨床實驗室國家標準化管理委員會標準(CLSI2008)。

1.9 無乳鏈球菌主要耐藥基因PCR檢測

對下列8種耐藥性基因進行PCR檢測：氨基糖苷類耐藥基因aphA和aad-6；四環素類耐藥基因tetO、tetL；青霉素類耐藥基因突變pbp2b；大環內酯類耐藥基因erm(A/T)、ermB；β-內酰胺類耐藥基因TEM；并對其進行序列測定。以提取的基因組DNA作為模板，采用上述引物PCR擴增各基因目的條帶。PCR反應體系25.0 μL：2×RapidTaqMasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s (pbp2b 1 min、TEM20 s)，按照表4退火溫度30 s (tetL1 min、pbp2b45 s、TEM20 s)，72 ℃延伸1 min(aphA延伸1 min、aad-6延伸1 min、tetL延伸1 min、pbp2b延伸1.5 min、TEM 延伸45 s)，共30個循環(ermB25 個循環、TEM34 個循環)；72 ℃終延伸10 min(TEM延伸 7 min)；4 ℃ 保存。各基因的特異性引物合成參考相關文獻[8-10]，相關信息見表4。

1.10 無乳鏈球菌主要毒力基因PCR檢測

參考已有研究[11-14]中的引物序列，利用表 5中的特異性引物對無乳鏈球菌9種主要毒力基因進行 PCR 檢測。scpB(cps 編碼的 C5a 肽酶)、hylB(透明質酸鹽裂解酶)、bac(β-C蛋白基因)、bca(α-C 蛋白基因)、cfb(CAMP因子)、cylE(β-溶血素)、fbsA(纖維蛋白原結合蛋白A)、lmb(黏連蛋白結合蛋白)、Sip(表面免疫原性蛋白)，并對其進行序列測定。以提取的基因組DNA作為模板，采用上述引物PCR擴增各基因目的條帶。PCR反應體系同“2.8”節。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 變性30 s (Sip1 min)，按照表5退火溫度 30 s (Sip1 min、cylE40 s)，72 ℃延伸30 s(Sip延伸 1 min)，共30個循環(cfb、fbsA、cylE、hylB35 個循環)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保存。各基因的特異性引物和相關信息見表5。

表4 耐藥基因引物序列

表5 毒力基因引物序列

2 結果與分析

2.1 無乳鏈球菌分離鑒定

2.1.1 形態學特征 從147份乳樣中共分離出6株無乳鏈球菌，分離率為4.1%。觀察分離菌的培養特征，純化后的無乳鏈球菌菌液劃線于脫纖維無菌綿羊血瓊脂平板上的菌落出現灰白色，表面光滑、露滴狀菌落，菌落周圍出現透明的β溶血環(圖1-a)；經革蘭氏染色后該菌在顯微鏡下呈現藍紫色的革蘭氏陽性球菌，短鏈或長鏈排列(圖1-b)。

2.1.2 分離菌生化試驗鑒定結果 生化試驗參照鏈球菌生化鑒定手冊，生化試驗結果見表6。由表6可知，分離菌的V-P、精氨酸、PMG、蕈糖、蔗糖和 CAMP試驗結果均為陽性，PYR、GPP、七葉靈、MAG、TMZ、山梨醇及觸酶試驗均為陰性。分離菌的試驗結果結合鏈球菌生化鑒定手冊與無乳鏈球菌的生化反應一致。

表6 無乳鏈球菌生化鑒定

2.1.3 CAMP試驗結果 CAMP反應結果見圖2。

2.2 分離菌株的PCR鑒定結果和系統發育進化樹構建結果

對147份樣品純化后的鏈球菌屬菌液進行PCR鑒定。由電泳結果(圖3)可知，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，產物大小與預期大小一致，其中，6株經無乳鏈球菌特異性引物PCR擴增后，在345 bp處出現特異性擴增條帶，但未分離出乳房鏈球菌。147份乳樣病原菌分離率見表7，將PCR產物送至睿博興科生物技術有限公司測序，并在NCBI上對序列進行在線比對，6株分離菌與無乳鏈球菌的相似度均在97%以上，由此可確定其中6株菌為無乳鏈球菌。

表7 147份乳樣細菌分離鑒定

試驗分離菌擴增的片段經測序后分別與不同的5種基因片段比對，由圖4、圖5可知，6株無乳鏈球菌(WR1-6)的測序片段與GenBank編號CP033808.1、CP012480.1、CP026084.1、CP010319.1、CP026082.1的無乳鏈球菌基因組的片段同源性較高。

2.3 分離菌藥敏試驗結果

由表8可知，分離得到的無乳鏈球菌主要對萬古霉素、恩諾沙星、頭孢噻肟、新霉素高度敏感，對其他藥物表現中度敏感或耐藥。

表8 無乳鏈球菌對常見抗生素的藥敏試驗結果

2.4 分離菌耐藥基因檢測

對分離的6株無乳鏈球菌分別進行氨基糖苷類耐藥基因aphA和aad-6，四環素類耐藥基因tetO、tetL，青霉素類耐藥基因突變pbp2b，大環內酯類耐藥基因erm(A/T)、ermB，β-內酰胺類耐藥基因TEM共8種耐藥基因進行PCR檢測，并對其進行測序比對。由圖6至圖9可知，從分離株中檢測到四環素類耐藥基因tetL、青霉素類耐藥基因突變pbp2b、大環內酯類耐藥基因ermB、β-內酰胺類耐藥基因TEM，檢出率為100%，其余耐藥基因均未檢出。

2.5 分離菌毒力基因檢測

由圖10至圖14可知，對分離的6株無乳鏈球菌進行9種毒力基因scpB(cps 編碼的 C5a 肽酶)、hylB(透明質酸)、bac(β-C蛋白基因)、bca(ɑ-C蛋白基因)、cfb(CAMP因子)、cylE(β-溶血素)、fbsA(纖維蛋白原結合蛋白)、lmb(黏連蛋白lmb蛋白)、Sip(侵襲蛋白)PCR檢測，并對其進行測序比對。其中cfb、cylE、fbsA、hylB和Sip基因檢出率達100%，其余毒力基因均未檢出。

3 討論與結論

無乳鏈球菌作為乳房炎主要病原之一，是一種傳染性很強的乳腺炎病原體。它往往定殖于受感染奶牛的乳房組織、乳頭和生殖道中，一般是由于擠奶工的手或擠奶機中的吸奶杯消毒不夠徹底或消毒劑殺菌率較低而導致接觸性傳播的。李宏勝等對我國6個城市的乳房炎奶樣進行細菌學調查發現，無乳鏈球菌總分離率為15.56%[15]。劉琪等對內蒙古部分地區奶牛乳房炎奶樣的分離結果表明，無乳鏈球菌的感染率為4.24%[16]。杜琳等對華北地區奶牛場隱性乳房炎病牛乳樣進行細菌學調查發現，無乳鏈球菌的分離率為5.03%[1]。王蒴等對新疆4個地區牛場的乳房炎奶樣檢測結果表明，無乳鏈球菌的感染率為17.27%[17]，尹欣悅等對新疆某牛場的乳房炎奶樣檢測結果表明，無乳鏈球菌的分離率為3.33%[18]。因無乳鏈球菌感染引起的具有高度傳染性的乳房炎病例廣泛存在于我國各地區，故對無乳鏈球菌的耐藥表型及毒力因子的研究具有重大意義。本研究從臨床型乳房炎牛和隱形性乳房炎牛中，共計采集147份的乳樣中共分離到6株無乳鏈球菌，分離率為4.1%。低于李宏勝等在多個地區檢測的無乳鏈球菌的分離率[15]，同樣也低于王蒴等在新疆地區的分離率[17]，但與劉琪等、杜琳等、尹欣悅等對內蒙古部分地區、華北地區、新疆某牛場中無乳鏈球菌的分離率[16，1，18]近似。引起奶牛乳房炎主要病原菌的分離率之所以存在一定差異，可能與不同地域環境、不同季節、不同飼養管理方式、采用不同抗菌藥物的治療有關。

現階段，雖已具有針對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌等病原菌引起的奶牛乳房炎的一系列相關疫苗應用于奶牛乳房炎的防控中，但是抗生素治療仍是首選的治療方法。Zigo等的研究結果顯示，3株無乳鏈球菌對苯唑西林、鏈霉素的耐藥率分別為8.7%和30.4%，對青霉素和頭孢噻呋高度敏感[19]，本研究結果與之有一定差異，表明新疆部分地區的規模化奶牛場在臨床上治療奶牛乳房炎使用抗生素時，應優先選擇萬古霉素、頭孢噻肟、新霉素及喹諾酮類藥物。張保海等的研究結果顯示，對青霉素耐藥的105株無乳鏈球菌中，β-內酰胺類的TEM耐藥基因的檢出率為98%[10]。楊明偉等研究結果顯示，4種氨基糖苷類耐藥基因aph(3′)Ia、aac(3′)Ib、aac(6′)Ib和ant(3′)I的檢出率分別為0.0%、0.0%、31.3%和75.0%[20]，本研究結果與之基本一致。

結合耐藥表型和耐藥基因分析，新疆部分地區的規模化奶牛場中分離出的無乳鏈球菌對β-內酰胺類藥物具有較高的耐藥性，但對喹諾酮類藥物及頭孢類、糖肽類、氨基糖苷類藥物敏感，這與尹欣悅等研究的無乳鏈球菌的耐藥表型[18]基本一致，在今后的治療中可優先選擇喹諾酮類藥物并且配合頭孢類和氨基糖苷類藥物交替使用。

無乳鏈球菌為常見的條件性致病菌，對人、牛及水生動物均表現易感，對無乳鏈球菌致病力起促進作用的包括多種表面蛋白和內毒素，這些致病因子使無乳鏈球菌具有很強的吸附力、抗吞噬及免疫逃避能力[21]。祝宇等對云南地區牛源無乳鏈球菌cfb和CAMP這2種毒力基因的檢出率分別為100.0%和8.8%，其中，cfb的檢出率[9]與本試驗一致。Carvalho-Castro等對巴西奶牛源無乳鏈球菌cfb的檢出率為100.0%，bac檢出率為0.0%[22]，本試驗結果與之一致，但fbsA檢出率(42.37%)低于本研究的100%。張陽等對河南牛無乳鏈球菌hylB的檢出率為20.65%，低于本研究的100.00%，ScpB和bca的檢出率分別為48.39%、56.77%，均高于本研究結果(0.00%)，但bac的檢出率為0.00%[8]，本研究結果與之一致。高菊梅等對寧夏地區牛源無乳鏈球菌Sip的檢出率為31.8%[7]，低于本研究的100%。張保海等對四川部分地區奶牛源無乳鏈球菌cylE的檢出率為100%[10]，本試驗結果與之一致。Lmb蛋白不僅是調節細菌體內金屬穩態的關鍵，而且能識別黏連蛋白從而發揮黏附作用，但這類蛋白僅存在于人源無乳鏈球菌，在牛源菌上基本不存在[23]。這些毒力因子為病原體侵入宿主提供了必要的幫助，也可能直接參與宿主感染的過程。

本研究從新疆部分地區規模化奶牛場因無乳鏈球菌感染所引起的奶牛乳房炎的奶牛中分離出6株無乳鏈球菌攜帶cfb、cylE、fbsA、hylB、Sip毒力基因和介導β-內酰胺類藥物耐藥的TEM基因、四環素類藥物耐藥的tetL基因、青霉素類藥物耐藥的pbp2b基因、大環內酯類藥物耐藥的ermB基因，且對喹諾酮類藥物和氨基糖苷類、頭孢類、糖肽類藥物敏感，對β-內酰胺類的多種藥物表現高度耐藥。