電針聯合骨髓間充質干細胞移植修復脊髓損傷的研究淺析*

郭智超 孫忠人 尹洪娜

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150006）

脊髓損傷（SCI）在中醫學中沒有明確的對應病名，但是其癥狀與“痿病”相近，所以通常將脊髓損傷歸于“痿病”一類，也有專家稱為“體墮”。胥林波認為，督脈與脊髓關系密切，不僅生理功能聯系緊密，病理影響也相互依存。督脈循行于人體背部，為“陽脈之海”，具有調節全身陽經經氣的作用。當督脈受到損傷后，會出現氣血瘀阻，產生全身麻木、活動受限的癥狀［1］。

急性SCI是指各種原因導致的脊髓結構功能的損害，損傷平面以下感覺、運動功能障礙，可分為原發性和繼發性兩種。原發性SCI是指當脊髓受到外力作用后的損傷［2］。繼發性SCI是指損傷后由于多種原因造成的二次損傷，主要與損傷部位的微循環有關，包括過度的促炎癥反應、脊髓細胞的死亡、凋亡、脂質過氧化等［3］。

電針作為一種具有顯著療效的非手術治療方式，具有副作用小、效果明顯、經濟安全等優點，在臨床中被廣泛應用。目前有許多研究表明，電針具有抑制受損脊髓組織細胞的凋亡、促進神經生長因子（NGF）的表達、抑制血栓的生成、促進脊髓屏障中血管內皮的再生等作用［4］。但電針治療SCI的治療機制還有待深入研究。

使用干細胞的目的在于通過引導軸突生長來維持和重新髓鞘化、促進損傷和存活神經元的營養供應以及加速脊髓自身細胞的增殖來恢復組織基質［5］。間充質干細胞作為干細胞的一種，是具有自我更新和多向分化的基質細胞，被稱為“萬能細胞”。可以從多種組織中進行分離，如臍帶、骨髓、脂肪組織等，并且可以分為多個亞群，這些亞群不僅和某些細胞譜系的分化有關，而且和本身的再生能力有關。即使是同一組織內也會因炎癥變化，分離分化而產生不同。正因為這些部位容易獲取且治療效果明顯，逐漸應用于實驗和臨床中［6-7］。BMSCs移植作為臨床中廣泛應用的一種干細胞移植手段，具有來源廣、分化能力強、穩定性好等優點［8］。本文就電針聯合BMSCs移植對SCI的修復機制及時間效應進行淺析。

1 電針治療SCI機制研究

電針在鎮痛、改善神經元功能、抑制細胞自噬、焦亡、凋亡、鐵死亡［9］和炎癥等相關通路進行修復SCI方面的作用中得到了廣泛的證實［10］。姚夢莉等研究發現選用雙側懸鐘、陽陵泉兩個穴位進行電針治療可以提升白細胞介素-1受體拮抗劑（IL-1Rα）的含量，降低腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-β（IL-1β）及白細胞介素-6（IL-6）的表達進行抗炎，減少繼發性SCI的損害［11］。同時使用不同的波形對于SCI的治療機制也會產生差異。有研究表明，使用疏密波進行電刺激能夠使對運動神經起營養支持作用的神經營養因子-3（NT-3）含量增加，加快SCI的逆轉運速率，同時使TrkC受體、mRNA的表達水平均明顯提升［12］，并且疏密波還可以促進SCI的血液循環，提升超氧化物歧化酶（SOD）活性，并顯著降低丙二醛（MDA）含量，從而避免自由基及其代謝產物對損傷部位的損害，改善神經組織，使新陳代謝加快，加速炎癥吸收［13］。有學者發現，當使用斷續波進行電刺激時，不僅可以加速受損部位炎癥的減退，促進局部壞死和崩解產物的消除，使局部微循環得到改善，神經髓鞘及其細胞核不斷增多，從而促進神經的再生，并且斷續波還可以使損傷部位失去神經控制的肌纖維進行主動性收縮，逐漸恢復肌細胞固有的收縮和舒張特性，減慢因失去神經支配后肌蛋白的變性過程，進而促進SCI的恢復［14］。

2 BMSCs治療SCI機制研究

2.1 BMSCs保護機制

SCI可分為兩個階段，即初級階段和二次損傷階段。在大多數的情況下，原發性損傷后的繼發階段更為重要，是防治損傷傳播的治療靶點。當二次損傷發生后，會加重組織損傷、細胞膜內外失衡、神經元細胞凋亡和血脊髓屏障被破壞等，最終造成脊髓神經功能喪失，并伴隨SCI中持久的膠質和纖維化疤痕的發展［15］。

2.1.1 抗炎 巨噬細胞主要有M1型和M2型兩種，M1型巨噬細胞是典型的促炎細胞，通過糖酵解進行吞噬和殺傷，在脊髓損傷初期向組織集合，逐漸形成瘢痕組織。M2型巨噬細胞的特性是產生抗炎因子，依賴氧化磷酸化（OXPHOS）持續產生能量進行組織修復。BMSCs能有效地為損傷部位進行抗炎，張繼峰等［16］發現骨髓間光質干細胞能夠減少膿毒癥大鼠炎性細胞浸潤，M2巨噬細胞數量明顯降低，調控肺泡巨噬細胞NF-κB（P65）蛋白入核，即損傷發生后，通過BMSCs和MSR1聯合有助于增強M2極化表型進行抗炎。另外有實驗表明通過提取BMSCs的外體（BMSC-Exos）對已經建模肌腱骨損傷的小鼠進行組織學、免疫熒光以及PCR定量實驗發現，BMSC-Exos可以抑制細胞凋亡，誘導M2型巨噬細胞極化，分泌過量的抗炎因子，加速骨質的愈合［17］。

2.1.2 抗氧化 氧化應激是指當機體受到刺激后產生過量的活性氧，導致與抗氧化防御系統平衡狀態失衡，引起機體損傷［18］。SCI后氧化應激的出現導致：1）細胞膜結構遭到破壞，內外離子失衡，導致神經功能紊亂；2）線粒體抗氧化功能受損，導致運動神經元死亡；3）加速谷氨酸釋放速度，增加運動神經元對興奮性毒性的敏感性等多種繼發性損害［19-21］。實驗表明，將BMSCs移植到SCI部位后進行觀察有明顯改善，BBB評分3 d后開始降低并持續恢復，作為氧化應激標志性指標的SOD活性提升，損傷部位的抗氧化能力持續增強［22］。Kyan在實驗中將培養后的BMSCs血清直接注射SCI處發現，與其他組相比，本組氧化應激代謝物的產量明顯降低，BMSCs對氧化應激水平降低，能夠最大限度地減少對軸突的二次損傷程度［23-24］。

2.1.3 抗細胞凋亡 細胞凋亡作為細胞死亡方式的一種，是為了維持機體神經系統正常發育、保持細胞數量動態平衡的一種必要過程，是一種為了更好適應生存環境進行主動性死亡的過程。其過程主要表現為：當受到不同內外環境刺激時，會引發不同途徑介導的一系列凋亡起始，導致凋亡小體的形成，之后凋亡小體會激活相應的Caspases家族引發級聯反應，最終導致凋亡的出現［25］。Li等在研究中將BMSCs中的線粒體直接或間接通過納米管的方式移植到受損部位，實驗表明，線粒體內化后改變了凋亡率和凋亡相關蛋白質運動神經元的表達，促進了神經元的生存；與SCI組相比，線粒體組大鼠BBB評分顯著提高，促進了SCI大鼠運動功能的恢復，說明BMSCs的移植能夠有效地促進凋亡的下降，損傷部位的恢復［26］。大量研究表明，當脊髓損傷發生后神經細胞的相繼凋亡，其凋亡特征為主要分布在白質上，凋亡細胞以膠質細胞為主［27］。而膠質細胞具有連接神經遞質、突觸的橋梁作用，并且能夠參與多種細胞、神經因子的修復、生長。大量研究表明，BMSCs移植能夠提高神經元細胞向少突膠質細胞的分化水平，更好地調節膠質細胞與神經元之間的平衡，增加少突膠質細胞的成活率，從而抑制細胞凋亡［28］。

2.2 BMSCs神經再生機制

突觸作為神經元胞體的延伸部分，對于神經系統的可塑性恢復具有重要意義，軸突作為其中的一種，主要作用就是將神經元胞體的興奮沖動傳遞至其他神經元或效應器上。在一般情況下，當SCI發生后軸突不能再生，其部分原因是缺乏神經營養因子（NGF），包括由腦源性神經營養因子（BDNF）、NT-3和神經營養因子4/5（NT-4/5）組成的生長因子家族［29］。它們對神經的生存、發育、功能維持和中樞神經系統（CNS）的可塑性至關重要。即使軸突能夠再生，它們也很少針對正確的突觸后神經元或形成突觸連接來恢復功能［30-34］。

研究證明BMSCs能夠給細胞提供營養，通過提供生長因子支持神經干細胞的生長和分化。據報道，BMSCs能夠很好地表達神經營養因子并且有良好的受體親和力［35］，這在神經細胞的發育、再生和存活中非常重要。在較早的研究中，研究人員將BMSCs在含有胎兒牛血清中進行培養，發現未被治療的細胞中BDNF、GDNF、NGF、NT3和NT4/5基因的表達也顯著增加［36］。Min Ye等為了研究BMSCs分泌膠質細胞和衍生神經營養因子（GDNF）的能力，分別通過反轉錄酶聚合酶鏈反應和酶相關免疫素檢測（ELISA）檢測了BMSCs的GDNF和蛋白質表達。當BMSCs培養3 d時，檢測到GDNF和蛋白質，當培養3、7、10 d后逐漸增加，說明了BMSCs具有明顯的分泌GDNF的潛力［37］。大量研究表明，BMSCs分泌NTFs并促進神經修復、招募支持細胞或修復受損組織。BMSCs移植到受損的中樞神經系統后，能直接定居在損傷部位，取代失去的神經元，分泌生長因子，改善突觸可塑性恢復，并提供促進細胞存活的微環境［35］。即通過BMSCs移植，能夠使神經營養因子允許軸突延長并以正確的數量向適當的目標延伸，提高細胞存活率，最終對損傷部位的神經生長起到積極作用。

3 BMSCs與電針治療SCI的聯合作用

3.1 作用機制聯合

BMSCs和電針在治療脊髓損傷方面都表現出了極大的潛能，并且兩者可以相互配合，共同作用在SCI受損部位。已有學者發現，BMSCs的增殖分化，可以加速誘導電針對SCI運動及感覺功能的改善，減少繼發性疾病，從而加速損傷的恢復。有學者證實電針可以改善脊髓損傷部位的微環境，促進移植干細胞的遷移。Hui Jind等在體外培養干細胞的NT-3和TRKC基因的神經網絡支架后，通過電針進行干預，發現因子的再生數量明顯增高，并能維持原有的突觸結構，建立新的突觸狀衍生神經元［38］。Ying Ding等將BMSCs移植和電針治療相結合直接作用于受損大鼠部位發現，相比較其他組，本組的NT-3含量增加，BBB評分顯著提高，肌纖維偶爾能進行主動性收縮。熒光免疫化學染色顯示，移植的BMSCs能夠分化成神經元狀細胞或膠質狀細胞，使細胞含量顯著增加［39］。

電針能夠刺激神經元的去極化，導致神經膠質細胞某些電壓門離子通道開啟，進而刺激細胞內CAMP水平升高和神經營養因子的自動釋放，增加組織的CAMP水平和神經營養因子的表達，如NT-3、BDNF、NGF和GDNF。CAMP作為被第一個識別的第二信使，具有調節神經遞質合成的作用，在對細胞外的反應中具有重要影響。CAMP水平的提高能夠有效促進激素分泌，促進軸突生成，加速下游激活復合物的形成，推動細胞生長［40］。此外一些研究已經表明BMSCs能夠分泌各種生長因子和細胞因子［36］，促進體內的軸突生長。同時，電針治療可以抑制脊髓損傷后星形細胞的活性增殖，并防止形成膠質疤痕。因此，結合BMSCs移植和電針治療可以相互配合改變病變部位的有害環境，通過增加神經營養因子和CAMP水平，抑制膠質疤痕的形成，促進軸突再生。

3.2 時間窗聯合

對于時間窗的理解，目前主要有兩種比較認可的說法。對于電針治療SCI方面也有同樣的兩種相關理解。

一是開始介入治療的時間切入點［41］。王婷婷等在造模成功的急性SCI大鼠，給予不同時間點開始進行治療，研究結果發現，雖然電針組均優于對照組，但當造模成功2 h時就進行電針治療效果最顯著，SOD和一氧化氮（NO）含量明顯提高，能夠有效清除自由基，保護受損的脊髓組織［42］。高連軍在不同時間點進行SCI治療后通過磁共振成像進行有效對比后發現，在SCI后2～4 h進行電針治療，纖維束修復程度明顯改善［43］。二是介入治療的有效療程［44］。電針在對于治療SCI療程上的不同，也會產生不同治療效果。有學者在不同時間段對損傷的大鼠進行電針治療時發現，第3天開始，腦源性神經因子數量開始高于對照組，在2周時呈現到最高狀態，第4周時，電針組與損傷組差別不大［45］。以上研究能夠說明在SCI發生后，電針越早的介入，進行有效治療，對于損傷后的治療效果越明顯［46］，但達到2～3周的治療時間后，會達到峰值，繼續進行電針治療，雖有效果，但作用逐漸降低。但具體時間，尚有待研究。對于BMSCs治療SCI也有相對顯著的治療時間窗。即當SCI發生后，不需要立即進行BMSCs的移植處理，在SCI損傷后期能夠為移居的干細胞提供一個更加適合的環境，避免了移植排斥，病毒抗原的風險，讓自體再生成為可能［47］。研究表明，在3 d時開始移植BMSCs使損傷部位的干細胞存活率提升，且遷移距離明顯增強，能夠有效抑制炎性因子的釋放，重建受損的血腦屏障［48］。

因此，在SCI發生后，可以立刻進行電針治療，清除自由基，使纖維素進行有效修復。在損傷發生3 d后，在進行電針治療的同時，開始移植BMSCs，為干細胞營造一個適合的環境，促進神經因子的有效再生。當電針治療進行到2～3周時，減少電針的治療手段，配合其他康復療法進行SCI后的修復。二者在時間窗上的聯合應用，對于SCI后的恢復，能夠達到顯著的療效。

4 總結與展望

SCI是一個十分復雜的病程，對于其損傷部位和繼發性的發展有眾多的不確定因素，各個通路、各個環節間層層影響。對于以往的研究大多都是電針對鎮痛、炎癥、神經細胞損傷等單一方面，并不能把每個環節、通路進行聯系，其研究效果不明顯。隨著針灸技術、文化思想的不斷深入發展，電針治療SCI逐漸普遍應用于臨床，其簡便，療效顯著，無副作用等治療優勢也不斷被展現，但是對于治療機制尚研究不足。

近年來，間充質干細胞被作為“萬能細胞”被廣泛研究，尤其BMSCs具有分化增殖力強，適應度高等優點能與不同治療手段相結合，應用在治療眾多疾病方面，這給電針治療SCI提供了一個全新的思路。二者結合在促進神經營養因子、抑制細胞死亡、改善損傷部位炎癥方面可以達到事半功倍的效果。但是在目前的研究中尚有幾點局限性尚需解決。1）目前的研究中多集中在短期的實驗效果方面，尤其電針的長期干預及其持久效果尚未可知。2）電針聯合BMSCs的研究目前尚局限在相關蛋白方面，還不能從基因、代謝方面進行說明其相關影響。3）針對電針聯合BMSCs，如何能從SCI眾多的疾病影響環節中，找出相對長期、有效、與人體親和度高的治療方法仍是我們追尋的目標。