miR-143-3p通過調控CX3CL1/CX3CR1信號通路對脂多糖誘導肺泡上皮細胞損傷的影響

荊忻 邵萍 李學莉

1寧夏醫科大學總醫院心腦血管病醫院重癥醫學科（銀川 750001）；寧夏銀川市第一人民醫院2呼吸與危重病醫學科，3重癥醫學科（銀川 750001）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）以進行性呼吸窘迫、頑固性低氧血癥和非心源性肺水腫為臨床特征，而重度的ALI即為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），具有較高的發病率和死亡率。ALI的特點是肺泡-毛細血管膜通透性增加，彌漫性肺泡損傷、水腫以及過度的肺部炎癥和肺泡上皮細胞凋亡［1］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是細菌感染引起ALI的主要致病因素之一［2］。因此，LPS常被用來誘導肺泡上皮細胞損傷，來建立ALI的體外細胞模型，其特點是肺泡上皮細胞炎癥和凋亡增強［3］。微小RNA（miRNA）通過負向調控蛋白編碼基因的表達，參與各種細胞過程的調控，包括炎癥反應［4-5］。近年來發現抑制miR-92a可以通過靶向TLR2/AP-1軸減輕ALI大鼠肺水腫，改善LPS誘導肺泡上皮細胞損傷［6］。miR-143-3p位于5q32染色體上，具有抗腫瘤、抗炎等作用［7-8］。近期研究［9］顯示miR-143-3p過表達可改善支原體肺炎小鼠炎癥因子水平，減少肺上皮細胞凋亡。但是，miR-143-3p是否在ALI中起作用仍不清楚。因此，本研究將觀察miR-143-3p在ALI/ARDS患者外周血中的表達水平以及其對LPS誘導的肺泡上皮細胞損傷的影響，并探討miR-143-3p與趨化因子（C-X3-C基元）配體1（chemokine（C-x3-C unit）ligand 1，CX3CL1）/趨化因子（C-X3-C基元）受體1/（chemokine（C-x3-C unit）receptor 1，CX3CR1）信號通路的關系，旨在為臨床診治ALI/ARDS提供新型指標監測及研究方向。

1 資料與方法

1.1 臨床資料及樣本收集 本研究獲得寧夏醫科大學總醫院倫理委員會批準，批準號為2019.029，且遵循《赫爾辛基宣言》中涉及人體的醫學研究的倫理原則。所有參與者均獲得書面知情同意。根據ARDS柏林定義診斷ALI/ARDS。納入標準如下：（1）年齡＞ 18且＜ 80歲；（2）診斷為ALI/ARDS。排除標準：（1）有肺纖維化；（2）肝腎功能異常；（3）臨床肺部感染評分顯示為肺炎；（4）心功能不全引起肺水腫；（5）需要體外膜氧合支持。2019年7月至2021年5月在本院急診科就診的符合上述標準的ALI/ARDS患者共46例，其中男24例，女22例，平均年齡（58.53±8.62）歲，記為ALI/ARDS組；同時選取在相同時間段進行體檢的46例健康者，其中男25例，女21例，平均年齡（58.61±8.65）歲，記為Normal組。ALI/ARDS組患者在診斷ALI/ARDS后30 min內進行外周血采集，Normal組健康體檢者在清晨空腹時采集外周血，所有樣本離心后取上清液，獲得外周血血清，并保存在-20℃冰箱中備用。

1.2 實驗試劑與儀器 人肺泡上皮細胞A549購自美國ATCC公司。LPS購自北京索萊寶；Lipofectamine 2000轉染試劑購自上海篤瑪生物；模擬物陰性對照（NC mimic）、miR-143-3p模擬物（miR-143-3p mimic）、抑制物陰性對照（NC inhibitor）、miR-143-3p抑制劑（miR-143-3p inhibitor）、空載體質粒（pcDNA）、CX3CL1重組載體質粒（pc-CX3CL1）購自上海拓然生物；TRIzol、Annexin V-FITC/PI雙染色流式細胞凋亡檢測試劑盒、BCA試劑盒購自上海碧云天；SYBR Green Real-time PCR Master Mix購自上海欣百諾生物；MTT試劑盒及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、血管內皮生長因子（VEGF）和降鈣素原（PCT）ELISA試劑盒購自武漢默沙克；CX3CL1、CX3CR1和βactin的一抗、辣根過氧化物酶二抗購自艾博抗（上海）；增強型化學發光試劑盒購自南京諾唯贊。酶標儀購自山東博科科學儀器有限公司；流式細胞儀購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司。

1.3 雙熒光素酶實驗證實miR-143-3p與CX3CL1的靶向關系 TargetScan軟件預測到miR-143-3p與CX3CL1 3'UTR之間存在互作關系。構建CX3CL1野生型和突變型（WT/MUT-CX3CL1）熒光素酶載體，并將其分別與miR-143-3p mimic或NC mimic轉染至A549細胞中，48 h后采用雙熒光素酶報告系統測量熒光素酶活性。

1.4 細胞培養、轉染、LPS處理與分組 人肺泡上皮細胞A549在RPMI-1640培養基培養。細胞生長至對數期時使用1 mg/L的LPS［10］處理來誘發細胞損傷，并將其記為LPS組，不經LPS處理的A549細胞作為Control組。然后利用Lipofectamine 2000轉染試劑將 NC mimic、miR-143-3p mimic、miR-143-3p mimic和pcDNA、miR-143-3p mimic和pc-CX3CL1轉染至A549細胞，轉染24 h后使用1 mg/L的LPS進行處理，分別標記為LPS+NC mimic組、LPS+miR-143-3p mimic組、LPS+miR-143-3p mimic+pcDNA組、LPS+miR-143-3p mimic+pc-CX3CL1組，繼續培養24 h后收集各組細胞用于后續指標檢測。LPS組在細胞培養24 h后進行造模，并在造模后培養24 h進行相關指標檢測；Control組雖不進行造模，但培養時間與其他組相同，指標檢測的時間與其他組也一致。

1.5 qRT-PCR檢測miR-143-3p和CX3CL1、CX3CR1 mRNA表達水平 使用TRIzol提取外周血血清和各組肺泡上皮細胞的總RNA，并通過逆轉錄試劑盒合成cDNA。采用SYBR Green Real-time PCR Master Mix進行qRT-PCR擴增。采用2-ΔΔCt法對數據進行量化，以U6或β-actin為內參。qPCR引物：miR-143-3p正向：5'-GAGATGAAGCACTGTAGCT-3'，反向：5'-GAACATGTCTGCGTATCTC-3'；U6正向：5'-ACAGATCTGTCGGTGTGGCC-3'，反向：5'-GGCCCCGGATTATCCGACATTC-3'；CX3CL1正向：5'-TCCGATATCTCTGTCGTGGC-3'，反向：5'-TGTCTCGTCTCCAAGCAGC-3'；CX3CR1正向：5'-GACTTCTTCCACCATGAGCAG-3'，反向：5'-CCTCTAGTCGCTGTGGTGTTC-3'；β-actin正向：5'-AGAAAATCTGGCACCACACC-3'，反向：5'-CCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3'。

1.6 Western blot檢測CX3CL1、CX3CR1蛋白表達 提取外周血血清和各組肺泡上皮細胞總蛋白。BCA試劑盒測定濃度。然后將40 μg蛋白用10%的SDS-PAGE凝膠溶解，然后轉移到PVDF膜上。用脫脂奶粉在室溫下封閉膜4 h后，用抗CX3CL1、CX3CR1和β-actin的一抗在4℃下孵育一夜。然后與辣根過氧化物酶二抗在室溫孵育2 h。用增強型化學發光試劑盒檢測該蛋白。用Image-Pro Plus 6.0軟件對目的條帶進行量化。

1.7 MTT檢測細胞活力 將轉染后的各組肺泡上皮細胞A549以1×103/孔的密度接種至96孔板，并與20 μL MTT試劑共同孵育2 h，然后使用酶標儀檢測490 nm波長處的吸光度，并以實驗組與空白組的吸光度的百分比表示各組細胞的細胞活力。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡 將收集的各組轉染后的A549細胞分別加入100 μL 1×結合緩沖液，將其制成細胞懸液，然后依次加入Annexin V-FITC和PI，各5 μL，室溫下靜置30 min，再加入400 μL 1×結合緩沖液，最后上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.9 ELISA分析炎癥指標水平 按照實驗室購買的ELISA試劑盒說明書的操作步驟檢測各組細胞上清液中炎癥指標的水平，包括TNF-α、IL-1β、IL-6、VEGF和PCT。

1.10 統計學方法 實驗結果以6次重復實驗的均數±標準差表示。采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，采用單因素方差分析（ANOVA）或雙尾studentt檢驗進行多組或兩組間的差異比較，多組資料的兩兩事后比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-143-3p、CX3CL1和 CX3CR1在 ALI/ARDS患者外周血和LPS誘導的肺泡上皮細胞A549中的表達水平 與Normal組相比，ALI/ARDS組患者外周血中miR-143-3p表達降低，CX3CL1、CX3CR1的mRNA和蛋白表達升高（P＜0.05），見圖1。與Control組比較，LPS組A549細胞中miR-143-3p表達減小，CX3CL1和CX3CR1的mRNA和蛋白表達增加（P＜0.05），見圖2。

圖1 miR-143-3p、CX3CL1和CX3CR1在ALI/ARDS患者外周血中的表達水平Fig.1 Expression levels of miR-143-3p，CX3CL1 and CX3CR1 in peripheral blood of patients with ALI/ARDS

圖2 miR-143-3p、CX3CL1和CX3CR1在LPS誘導的肺泡上皮細胞A549中的表達水平Fig.2 Expression levels of miR-143-3p，CX3CL1 and CX3CR1 in LPS-induced alveolar epithelial cells A549

2.2 miR-143-3p過表達對LPS誘導的肺泡上皮細胞A549增殖、凋亡的影響 與Control組相比，LPS組miR-143-3p表達、細胞活力降低，凋亡率增加（P＜0.05）；與LPS組或LPS+NC mimic組比較，LPS+miR-143-3p mimic組miR-143-3p表達及細胞活力顯著升高，凋亡率明顯降低（P＜0.05），見圖3和表1。

表1 miR-143-3p過表達對LPS誘導的肺泡上皮細胞A549增殖、凋亡的影響Tab.1 Effect of miR-143-3p overexpression on proliferation and apoptosis of alveolar epithelial cells A549 induced by LPS ±s

表1 miR-143-3p過表達對LPS誘導的肺泡上皮細胞A549增殖、凋亡的影響Tab.1 Effect of miR-143-3p overexpression on proliferation and apoptosis of alveolar epithelial cells A549 induced by LPS ±s

注：與Control組比較，aP ＜0.05；與LPS組比較，bP ＜0.05；與LPS+NC mimic組比較，cP ＜0.05

組別Control組LPS組LPS+NC mimic組LPS+miR-143-3p mimic組F值P值miR-143-3p 1.00±0.02 0.49±0.03a 0.51±0.05 1.26±0.14bc 147.316＜0.001細胞活力（%）100.00±1.02 64.68±2.43a 63.57±2.16 89.45±3.28bc 354.996＜0.001細胞凋亡率（%）7.62±0.34 23.56±0.85a 22.48±1.03 13.74±0.69bc 577.950＜0.001

圖3 miR-143-3p過表達對LPS誘導的肺泡上皮細胞A549凋亡的影響Fig.3 Effect of miR-143-3p overexpression on apoptosis of alveolar epithelial cells A549 induced by LPS

2.3 miR-143-3p過表達對LPS誘導的肺泡上皮細胞A549炎癥指標的影響 圖4顯示，LPS組TNF-α、IL-1β、IL-6、VEGF、PCT含量明顯比Control組高（P＜ 0.05）；LPS+miR-143-3p mimic組TNF-α、IL-1β、IL-6、VEGF和PCT含量明顯低于LPS+NC mimic組和LPS組（P＜0.05）。

圖4 miR-143-3p過表達對LPS誘導的肺泡上皮細胞A549炎癥指標的影響Fig.4 Effect of miR-143-3p overexpression on inflammatory indicators in alveolar epithelial cells A549 induced by LPS

2.4 miR-143-3p靶向CX3CL1 TargetScan軟件預測發現miR-143-3p和CX3CL1的3'UTR存在互補的核苷酸位點，見圖5A。圖5B顯示，miR-143-3p mimics+WT-CX3CL1組相對熒光素酶活性比NC mimics+WT-CX3CL1組減小（P＜0.05），miR-143-3p mimics+MUT-CX3CL1組相對熒光素酶活性與NC mimics+MUT-CX3CL1組差異無統計學意義（P＞0.05）。與NC mimics組比較，miR-143-3p mimics組CX3CL1 mRNA和蛋白表達降低（P＜0.05）；與NC inhibitor組比較，miR-143-3p inhibitor組 CX3CL1 mRNA和蛋白表達升高（P＜0.05），見圖5C-D。

圖5 雙熒光素酶實驗證實miR-143-3p靶向調控CX3CL1Fig.5 Dual luciferase assay confirmed that miR-143-3p targeted regulation of CX3CL1

2.5 CX3CL1過表達逆轉miR-143-3p過表達對LPS誘導的肺泡上皮細胞A549細胞損傷的保護作用 與LPS+miR-143-3p mimic組、LPS+miR-143-3p mimic+pcDNA組相比，LPS+miR-143-3p mimic+pc-CX3CL1組CX3CL1蛋白上調表達，細胞活力下降，凋亡率升高，TNF-α、IL-1β、IL-6、VEGF、PCT水平增加（P＜0.05），見圖6-8、表2。

圖6 各組A549細胞中CX3CL1的表達水平Fig.6 CX3CL1 expression level in A549 cells of each group

圖7 miR-143-3p過表達對LPS誘導的肺泡上皮細胞A549凋亡的影響Fig.7 Effect of miR-143-3p overexpression on apoptosis of alveolar epithelial cells A549 induced by LPS

圖8 CX3CL1過表達逆轉miR-143-3p過表達對LPS誘導的肺泡上皮細胞A549炎癥指標的影響Fig.8 Effect of CX3CL1 overexpression reversing miR-143-3p overexpression on inflammatory markers in alveolar epithelial cells A549 induced by LPS

表2 CX3CL1過表達逆轉miR-143-3p過表達對LPS誘導的肺泡上皮細胞A549增殖、凋亡的影響Tab.2 Effect of CX3CL1 overexpression reversing miR-143-3p overexpression on proliferation and apoptosis of alveolar epithelial cells A549 induced by LPS ±s，n=6

表2 CX3CL1過表達逆轉miR-143-3p過表達對LPS誘導的肺泡上皮細胞A549增殖、凋亡的影響Tab.2 Effect of CX3CL1 overexpression reversing miR-143-3p overexpression on proliferation and apoptosis of alveolar epithelial cells A549 induced by LPS ±s，n=6

注：與LPS+miR-143-3p mimic組比較，aP＜0.05；與LPS+miR-143-3p mimic+pcDNA組比較，bP＜0.05

組別LPS+miR-143-3p mimic組LPS+miR-143-3p mimic+pcDNA組LPS+miR-143-3p mimic+pc-CX3CL1組F值P值CX3CL1 0.64±0.05 0.67±0.03 0.89±0.06ab 47.914＜0.001細胞活力（%）88.67±3.14 87.59±2.78 68.42±2.15ab 105.182＜0.001細胞凋亡率（%）14.12±0.71 14.05±0.68 20.36±0.79ab 148.545＜0.001

2.6CX3CL1過表達逆轉miR-143-3p過表達對LPS誘導的肺泡上皮細胞A549中CX3CR1表達的影響 LPS組CX3CR1 mRNA和蛋白表達高于Control組（P＜ 0.05）；LPS+miR-143-3p mimic組 CX3CR1 mRNA和蛋白表達比LPS組和LPS+NC mimic組低（P＜0.05）；與LPS+miR-143-3p mimic組和LPS+miR-143-3p mimic+pcDNA組比較，LPS+miR-143-3p mimic+pc-CX3CL1組CX3CR1 mRNA和蛋白表達升高（P＜0.05），見圖9。

圖9 CX3CL1過表達逆轉miR-143-3p過表達對LPS誘導的肺泡上皮細胞A549中CX3CR1 mRNA和蛋白表達的影響Fig.9 Effect of CX3CL1 overexpression reversing miR-143-3p overexpression on CX3CR1 mRNA and protein expression in alveolar epithelial cells A549 induced by LPS

3 討論

彌漫性肺泡損傷是ALI/ARDS的病理標志，而肺泡上皮細胞是抵抗機體感染的第一道屏障。在ALI/ARDS中，彌漫性肺泡損傷導致促炎細胞因子的釋放，進一步招募中性粒細胞到肺部，加重局部和全身的炎癥和組織損傷［11］。在本研究中，ALI/ARDS患者的外周血中均檢測到miR-143-3p下降和CX3CL1、CX3CR1升高，這使得進一步在肺泡上皮細胞中探討這三種因子的作用，從而通過體外實驗解釋miR-143-3p與CX3CL1、CX3CR1的調控關系及其對肺泡上皮細胞損傷的影響。

既往研究［12］表明，miRNA可作為多種疾病的生物標志物，如血清miR-150可作為ARDS篩查及預后預測因子，miR-122是心血管纖維化的早期預警生物標志物［13］。TIEDT等［14］研究表明，miR-143-3p與急性缺血性卒中相關，可能作為早期診斷標志物發揮臨床應用價值。而在ALI/ARDS中尚沒有關于miR-143-3p的研究。本研究發現，miR-143-3p在ALI/ARDS患者外周血中表達下調，說明其可能作為ALI/ARDS的診斷標志物。此外，LPS誘導的肺泡上皮細胞A549中miR-143-3p表達減小，細胞活力降低，凋亡率增加，提示細胞損傷模型構建成功。本研究通過轉染miR-143-3p mimic上調miR-143-3p表達發現A549細胞活力升高，凋亡率降低，揭示miR-143-3p過表達可有效減輕LPS誘導的肺泡上皮細胞損傷。

研究［1］表明，ALI/ARDS的主要原因是炎癥反應和抗炎反應之間的失衡，以及體液免疫和細胞免疫激活引起的不可控的全身炎癥反應。炎癥細胞因子如IL-6、IL-1β、TNF-α啟動級聯性炎癥反應，導致炎癥細胞因子浸潤和病理改變［15］。VEGF水平增加有利于提高內皮細胞通透性，而降低VEGF表達可間接減輕肺泡上皮細胞損傷，從而緩解ALI/ARDS病情［16］。PCT是一種蛋白質，當機體發生感染時，促炎因子的分泌增多，從而使PCT升高，而且PCT水平隨著ARDS患者病情的加重逐漸升高［17］。本研究結果顯示，miR-143-3p過表達后LPS誘導的A549細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、VEGF、PCT明顯降低，提示miR-143-3p可改善LPS誘導的肺泡上皮細胞的炎癥反應。

CX3CL1是CX3C家族的唯一成員，通過結合唯一受體CX3CR1參與炎癥的發生、誘導和活化，參與了諸多炎性疾病的發生與發展［18］。以往研究［19］顯示，CX3CL1在急性肺損傷大鼠肺組織中表達升高。本研究顯示，CX3CL1、CX3CR1 mRNA和蛋白水平在ALI/ARDS患者和LPS誘導的A549細胞中均表現上調，這與DING等［20］的研究一致，說明CX3CL1、CX3CR1參與調控ALI/ARDS進展。本研究通過TargetScan軟件預測和實驗證實miR-143-3p直接靶向調節CX3CL1表達。此外，本研究發現，在過表達miR-143-3p的基礎上上調CX3CL1蛋白表達可顯著抑制A549細胞活力，促進細胞凋亡和炎癥因子表達，同時增加了CX3CR1的表達水平，提示miR-143-3p過表達可通過抑制CX3CL1/CX3CR1表達減輕LPS誘導的肺泡上皮細胞損傷。

綜上所述，本研究首次發現miR-143-3p在ALI/ARDS患者和LPS誘導的肺泡上皮細胞中表達降低，并可能通過靶向抑制CX3CL1/CX3CR1通路改善LPS誘導的肺泡上皮細胞損傷，提示miR-143-3p可能作為ALI/ARDS的診斷標志物，也為ALI/ARDS的治療提供新的分子治療靶點。