丘腦腦源性神經生長因子-酪氨酸激酶受體B信號介導腦缺血誘發的痛覺過敏

金博文 李東娜 莊朋偉 郭虹 張艷軍

1天津中醫藥大學（天津 301617）；2天津中醫藥大學第一附屬醫院（天津 300193）

腦卒中后中樞性疼痛（central post-stroke pain，CPSP）是繼發于腦卒中之后的慢性中樞性神經病理性疼痛，其臨床癥狀主要為卒中后自發性疼痛、痛覺過敏、痛覺超敏和感覺異常［1］，是導致患者腦卒中后焦慮抑郁的主要原因之一，嚴重影響了患者卒中后恢復期的生存質量［2］。隨著腦卒中發病率和存活率的逐年上升［3］，CPSP患者數量逐漸增加，目前關于CPSP發病機制的研究主要集中在神經炎癥、中樞敏化和去抑制三個方面［4］，盡管近年來取得了一定進展，但CPSP的發病機制仍不完全明確，對臨床有效藥物的研發帶來了一定困難。

腦源性神經生長因子（brain-derived neurotrophic bactor，BDNF）是中樞神經系統中廣泛存在的一種基礎神經營養蛋白［5］。BDNF與其受體酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）結合后，自身產生磷酸化，經過磷酸化的TrkB可激活下游多種信號傳導途徑而發揮生物學功能［6］，研究表明，慢性疼痛過程中BDNF-TrkB通路的異常激活與痛覺過敏有著密切聯系［7］，是疼痛傳導過程中的關鍵調節因子，但關于BDNF在腦卒后中樞性疼痛的發病過程中起到的作用，目前尚無研究。本研究擬基于丘腦BDNF信號揭示腦卒中后中樞性疼痛的發病機制，為腦卒中后中樞性疼痛的防治提供一定線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 大鼠MCAO線栓（2838A5），北京西濃科技有限公司；小動物麻醉機，美國Matrx公司；石蠟包埋機，轉輪切片機，德國Leica公司；倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司；電泳槽，美國伯樂公司；凝膠成像儀，和信偉業科技有限公司。

1.1.2 實驗動物 SPF級8周齡雄性wistar大鼠60只，體質量270～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號SCXK（京）2019-0008。飼養于天津中醫藥大學動物中心。

1.1.3 試劑 Neun抗體（ab177487），驢抗山羊IgG H&L（Alexa Fluor?488）（ab150129），驢抗兔 IgG H&L（Alexa Fluor?647），英國Abcam公司；Iba1抗體（NB100-1028），Novus Biologicals；BDNF抗體（PB9075），TrkB抗體（BM4759），武漢博士德生物工程有限公司；β-actin抗體（GB15001），武漢賽維爾生物科技有限公司；GABAA Rα（sc-376282），圣克魯斯生物技術；HRP標記的山羊抗兔IgG H&L（A0208），上海碧云天生物技術有限公司；2，3，5氯化三苯基四氮唑TTC（T8170），尼氏染色試劑盒（G1432），北京索萊寶科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組和造模 腦卒中后中樞性疼痛動物模型的造模方法參考HYAKKOKU等［8］的造模方法并在此基礎上加以改進。大鼠隨機分為假手術組（SHAM組）10只，腦卒中模型組（CPSP組）50只。術前1 d運用熱板法測定大鼠熱痛閾值，作為基礎痛閾值。采用大腦中動脈阻塞線栓法（MCAO）建立局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，沿右側頸內動脈插入線栓并向前推進，直至大腦中動脈起始部被阻斷，60 min后緩慢拔除線栓，恢復供血，造成腦卒中模型，假手術組僅分離頸總動脈。造模后兩小時參照Zea Longa評分法評估模型［9］，評分為1～3分的大鼠視為腦卒中造模成功，術后3 d再次測定熱痛閾，以術前1 d測量值為參考值，篩選出熱痛閾下降超過50%的大鼠［10］，納入模型組（CPSP）。

1.2.2 大鼠熱痛閾測定 利用熱板法測定各組大鼠術前1 d、術后3、7、14、21、28 d熱痛閾值，將大鼠置于50℃的熱板儀上，以30 s為上限值，以舔后足或連續縮足為觀察指標，測試完畢，將大鼠放回籠中，間隔至少15 min后重復測試，測定3次，取后兩次平均值為熱痛閾值［11］。

1.2.3 腦組織TTC染色、HE染色和尼氏染色 術后3 d，從模型組和假手術組隨機選取1只大鼠處死，取其腦組織，-40℃冰箱冰凍10 min，棄去腦干，每2 mm切一片，切成均勻的6～7片，室溫避光用2%的TTC染液，室溫避光處理30 min，后用4%多聚甲醛固定24 h，拍照采集圖像［12］。術后28 d處死大鼠取其腦組織，4%多聚甲醛固定，經脫水后石蠟包埋切成5 μm薄片，固定于載玻片上，烘烤后，二甲苯脫蠟透明，梯度酒精水化，部分切片進行HE染色［13］，蘇木素染色5 min，鹽酸酒精分化，氨水返藍，伊紅染色1 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察；另一部分切片進行尼氏染色［14］，60℃尼氏染液染色30 min，95%酒精脫色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察，對丘腦VPL區尼氏體進行計數。

1.2.4 Neun免疫組化檢測和IBA1、BDNF免疫熒光檢測 術后28 d處死大鼠取其腦組織，4%多聚甲醛固定，經脫水后石蠟包埋切成5 μm薄片，固定于載玻片上，烘烤后，二甲苯脫蠟透明，梯度酒精水化，部分切片進行Neun免疫組化檢測，檸檬酸鈉熱修復，滅活內源過氧化酶，山羊血清封閉后，滴加兔源Neun（1∶200）4℃過夜孵育，洗去一抗后，37℃孵育HRP標記的山羊抗兔二抗（1∶50）30 min，DAB避光顯色，蘇木素復染后脫水封片。鏡下觀察并采集圖片，使用Image J分析平均光密度值。另一部分切片進行IBA1、BDNF免疫熒光檢測檸檬酸鈉熱修復，TritonX-100破膜，驢血清封閉，滴加山羊源 IBA1（1∶1 000）和兔源BDNF（1∶200）4℃過夜孵育，洗去一抗后，室溫孵育驢抗山羊和驢抗兔熒光二抗（1∶1 000）2 h，DAPI染核，抗熒光淬滅封片劑封片，鏡下觀察并采集圖片。

1.2.5 Western blot檢測丘腦 BDNF，TRKB 和GABAAR蛋白的表達 術后28 d處死大鼠取丘腦組織，-80℃冷藏，加入裂解液后剪碎，提取總蛋白，BCA蛋白定量，100℃5 min使蛋白變性，取一定量的蛋白樣品進行凝膠電泳，電轉至0.45 nm PVDF膜上后，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，恢復室溫，TBST洗膜5次，辣根過氧化物酶標記二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜5次，加入ECL熒光顯色。采用Image J軟件進行結果分析。

1.2.6 統計學分析 采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，研究結果計量資料采用均數±標準差表示，實驗數據圖形用GraphPad Prism 5.0軟件進行繪制，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦卒中模型評價 TTC染色結果如圖1、表1所示，正常大鼠腦組織被染成紅色，梗死腦組織被染成白色，與假手術組相比，模型組丘腦VPL區可見明顯白色梗死區，涉及疼痛處理的腦區在tMCAO術后3 d受到損傷，證明tMCAO模型可以損傷大鼠丘腦。造模后，CPSP組與SHAM組相比神經功能評分升高，大鼠出現神經功能損傷，腦卒中模型造模成功。

表1 腦梗死面積與神經功能評分值Tab.1 Infarction area and Neurological deficit scores ±s

表1 腦梗死面積與神經功能評分值Tab.1 Infarction area and Neurological deficit scores ±s

注：與SHAM組比較，*P＜0.05

組別SHAM組CPSP組腦梗死面積（cm2）0 5.52神經功能評分值（分）0 2.14±0.69*

圖1 腦卒中造模結果Fig.1 Results of stroke modeling

2.2 MCAO術后大鼠熱痛閾變化 50只大鼠進行MCAO造模后，術后死亡14只，共36只存活，大鼠熱痛閾值的變化如圖2、表2所示，術前各組大鼠熱痛閾差異均無統計學意義（P＞0.05）。MCAO造模后，11只大鼠出現熱痛閾下降的情況，發病率為30.55%，與臨床發病率一致［15］，將其納入CPSP組，測定其術后熱痛閾值，結果表明術后因MCAO導致的大鼠熱痛閾下降癥狀持續了至少28 d。

表2 MCAO術后大鼠熱痛閾變化Tab.2 Development of heat pain hypersensitivity induced by MCAO ±s

表2 MCAO術后大鼠熱痛閾變化Tab.2 Development of heat pain hypersensitivity induced by MCAO ±s

注：與SHAM組比較，*P＜0.05；與SHAM組比較，**P＜0.01；與SHAM組比較，***P＜0.001

組別SHAM組CPSP組術前1 d 19.88±3.45 18.88±2.6術后3 d 20.62±2.89 8.73±3.27***術后7 d 21.41±3.53 9.84±2.45***術后14 d 17.89±1.44 10.5±2.33***術后21 d 15.93±3.94 10.2±2.79*術后28 d 17.39±4.33 9.97±2.59**

圖2 MCAO術后大鼠熱痛閾變化Fig.2 Development of heat pain hypersensitivity induced by MCAO

2.3 丘腦HE染色、尼氏染色、Neun免疫組化染色 大鼠丘腦VPL區的病理損傷如圖3、表3所示，尼氏染色結果顯示，SHAM組大鼠丘腦VPL區神經元排列規則，胞體較大，呈椎體形或橢圓形，CPSP組丘腦VPL區正常神經元排列紊亂，尼氏體數量減少，染色變淺，尼氏體數量顯著降低（P＜0.05）。HE染色結果顯示，SHAM組腦組織均勻，神經元排列整齊、致密，胞核無固縮、變形，CPSP組腦組織損傷明顯，可見組織結構排列紊亂，細胞核形態紊亂，大量神經元細胞固縮，胞核消失。Neun免疫組化染色結果顯示，與SHAM組相比，CPSP組丘腦VPL區Neun陽性表達顯著減少，平均光密度值顯著降低（P＜0.05）。

表3 尼氏體計數和Neun免疫組化平均光密度值Tab.3 The number of Nissl bodies and average optical density value of IHC ±s

表3 尼氏體計數和Neun免疫組化平均光密度值Tab.3 The number of Nissl bodies and average optical density value of IHC ±s

注：與SHAM組比較，*P＜0.05，***P＜0.001

組別SHAM組CPSP組尼氏體計數/mm2 233.57±10.65 142.29±8.38***Neun免疫組化平均光密度值146.24±5.44 135.65±3.41*

圖3 丘腦VPL區尼氏染色、HE染色和Neun免疫組化染色Fig.3 The pathological changes of rat thalamus（VPL）

2.4 丘腦BDNF、iba1免疫熒光染色結果 免疫熒光結果如表4、圖4所示，丘腦VPL區存在小膠質細胞與BDNF共表達，與SHAM組相比，CPSP組丘腦VPL區iba1與BDNF陽性表達增多。表明小膠質細胞激活后分泌的BDNF可能與MCAO術后的痛覺過敏有關。

圖4 丘腦BDNF、iba1免疫熒光染色結果Fig.4 Results of IBA1 and BDNF immunofluorescence measurement

表4 丘腦BDNF、iba1陽性細胞計數Tab.4 Numbers of iba1+and BDNF+cells ±s，個/mm2

表4 丘腦BDNF、iba1陽性細胞計數Tab.4 Numbers of iba1+and BDNF+cells ±s，個/mm2

注：與SHAM組比較，***P＜0.001

組別SHAM組CPSP組iba1陽性細胞數109.72±21.38 158.4±20.67***BDNF陽性細胞數308.33±23.20 433.58±16.28***

2.5 丘腦BDNF、TRKB和GABAAR蛋白表達結果 大鼠丘腦BDNF、TRKB、GABAAR蛋白表達的結果如表5、圖5所示，與SHAM組相比，CPSP組大鼠BDNF、TRKB蛋白含量顯著升高（P＜0.05），GABAAR蛋白含量顯著降低（P＜0.05）。

表5 丘腦BDNF、TRKB和GABAAR蛋白表達結果Tab.5 Expressions of BDNF、TrkB、GABAAR ±s

表5 丘腦BDNF、TRKB和GABAAR蛋白表達結果Tab.5 Expressions of BDNF、TrkB、GABAAR ±s

注：與SHAM組比較，**P＜0.01，***P＜0.001

組別SHAM組CPSP組BDNF 0.69±0.01 1.31±0.01***TrkB 0.77±0.07 1.24±0.07**GABAAR 1.13±0.09 0.71±0.07**

圖5 丘腦BDNF、TRKB和GABAAR蛋白表達結果Fig.5 Expressions of BDNF、TrkB、GABAAR

3 討論

腦卒中后中樞性疼痛是腦卒中后一種常見的并發癥，發病機制尚不明確，是腦卒中并發癥中研究較少的一種并發癥，痛覺過敏是腦卒中后中樞性疼痛的主要癥狀之一［16］。HYAKKOKU 等［8］和TAKAMI等［17］證明tMCAO可以引起大鼠和小鼠的疼痛傳導纖維Aδ和Aβ纖維發生變化，可能與CPSP的發病機制有關，但并未對其深入研究。本研究采用tMCAO復制大鼠腦卒中缺血再灌注模型，運用神經功能評分進行模型評價，同時使用熱板法對腦卒中模型大鼠術前術后的熱痛閾進行測定，觀察大鼠術后熱痛閾值的變化。結果表明，MCAO術后，大鼠神經功能評分升高，大鼠腦卒中模型復制成功；熱板法結果顯示，腦卒中模型大鼠術后有一部分出現了痛覺過敏的癥狀，且與臨床腦卒中后中樞性疼痛的發病率相似［15］，表明通過tMCAO可以成功建立起CPSP動物模型。

丘腦是疼痛傳導通路中的重要組成部分，有研究表明約有50%左右CPSP患者存在丘腦損傷［18］，尤其是丘腦腹外側核的損傷［19］，極有可能引起腦卒中后中樞性疼痛的發生。目前絕大多數關于CPSP的研究均定位于丘腦的功能障礙上，尤其是腦卒中后中樞神經系統疼痛傳導通路中興奮與抑制的失衡，具體表現為中樞敏化和去抑制［20］。本研究首先使用了TTC染色評估tMCAO造模后大鼠術后3 d的腦梗死面積，在明確丘腦腹外側核存在損傷后，通過尼氏染色、HE染色和Neun免疫組化染色進一步考察丘腦的損傷，結果表明與SHAM組相比，CPSP組丘腦VPL區組織損傷明顯，尼氏體數量減少，Neun陽性表達降低，表明腦卒中后中樞性疼痛模型大鼠丘腦VPL區出現損傷。

腦源性神經生長因子（brain-derived neurotrophic bactor，BDNF）是中樞神經系統中一種重要的神經生長因子，研究表明，BDNF的異常表達與痛覺過敏有著密切聯系［21］，在神經病理性疼痛中，脊髓和背根神經節中的BDNF表達升高，BDNF激活其受體TrkB，降低K+/Cl-突觸后轉運體（KCC2）的表達［22］，導致Cl-外排減少，而 GABA 的中樞抑制性功能的發揮主要依賴于激活離子型GABAA受體引起的Cl-內流，KCC2的表達降低嚴重影響了GABA的中樞抑制性功能［23］，最終導致細胞內氯離子含量的升高，中樞神經系統興奮與抑制的失衡，脊髓背角神經元興奮性升高，最終導致痛覺過敏。小膠質細胞作為中樞神經系統的固有免疫細胞，小膠質細胞的激活密切參與痛覺過敏的發展［24］，神經損傷后，受損的初級傳入神經釋放趨化因子、信號分子和蛋白酶激活脊髓中的小膠質細胞，小膠質細胞中的BDNF表達升高，從而增強脊髓傷害感受回路的興奮性［25］。本研究采用了免疫熒光染色檢測了丘腦VPL區丘腦小膠質細胞的激活與BDNF的表達，同時運用Western blot檢測了丘腦BDNF、TrkB的蛋白表達，結果表明與SHAM組相比，CPSP組丘腦VPL區小膠質細胞的數量與BDNF表達增加，且出現小膠質細胞與BDNF共表達現象，Western blot結果顯示，與SHAM組相比，丘腦BDNF、TrkB表達顯著增加，表明腦卒中后中樞性疼痛模型大鼠丘腦BDNF、TrkB表達增加，且增加表達的BDNF是與小膠質細胞的激活有關。此外本研究發現與SHAM組相比，CPSP組丘腦GABAAR表達顯著降低，表明丘腦內除了受到BDNF/TrkB間接導致的GABA抑制功能減弱外，GABAAR的表達量降低將直接導致GABA抑制功能降低，中樞去抑制。目前尚未有文獻報道此現象，GABAAR有可能是腦卒中后中樞性疼痛發病機制中的另一個關鍵環節。

綜上所述，本研究利用免疫熒光技術和Western blot技術對腦卒后中樞性疼痛模型大鼠丘腦的小膠質細胞，BDNF，TRKB，GABAAR含量進行了研究，結果表明腦卒后中樞性疼痛模型大鼠丘腦小膠質細胞數量增加，BDNF，TRKB蛋白表達增加，GABAAR含量減少，丘腦內疼痛傳導信號興奮與抑制平衡被打破，提示丘腦內BDNF的升高可能是腦卒中后中樞性疼痛發病過程中的關鍵病理環節，可能為腦卒中后中樞性疼痛提供新的治療靶點和治療措施。