以可可堿為主的潮州野生茶樹資源的生化特征

黃亞輝，吳 凡，許澤輝，許俊清，曾 貞，莫曉麗

1.華南農業大學 園藝學院，廣東 廣州 510642；2.饒平縣益康茶葉有限公司，廣東 饒平 521000

野生茶種質資源一般是指芽葉經制作后可供飲用的山茶屬（Genus Camellia Linn.）植物的野生群體，多為茶組（Camellia Sect. Thea (L.)Dyer）植物。茶鮮葉中的生化成分是茶葉品質的物質基礎，也是茶樹遺傳信息的表達結果。茶多酚、茶氨酸、嘌呤生物堿等次生代謝產物具有抗氧化、神經調節等保健功效，其組分及含量也是影響茶葉適制性的關鍵因素[1]。此外，一些研究者通過生化成分分析對野生茶樹的親緣關系和進化層次進行較為初步的歸納，為茶樹育種研究節省了寶貴的時間成本。楊春[2]在江華苦茶的研究中發現，江華苦茶與云南大葉種生化成分相似，其中兒茶素的組成表現較為原始，江華苦茶應屬喬木型茶樹向灌木型茶樹進化的中間類型。在生物堿方面，可可堿含量較高亦屬于較為原始的性狀[3]。本研究通過對25份潮州野生茶樹資源進行生化成分測定，旨在從中發掘特異茶樹種質進而為資源的深入研究與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究中的25份野生茶樹資源來自潮州市鳳凰山和饒平鎮等地，隨機編號1 ～ 25。采摘時間為2021年4月，采摘標準為一芽三葉。

1.2 儀器及試劑

高效液相色譜儀（M8500AA，安捷倫科技有限公司），紫外可見分光光度計（UVmini-1280，島津公司），分析天平（GL323-1SCN，賽多利斯科學儀器有限公司），超純水器（EPEDE2-20TS，南京易普易達科技發展有限公司），冷凍高速離心機（Heraeus-Multifuge X1R，賽默飛世爾科技公司）。主要試劑：色譜級甲醇（A452-4，賽默飛世爾科技公司），色譜級異丙醇（A451-4，賽默飛世爾科技公司），色譜級三氟乙酸（76-05-1，上海麥克林生化科技有限公司）。

試驗所用標準品均購于上海源葉生物科技有限公司：可可堿（theobromine，Tb），咖啡 堿（caffeine，Cf）， 苦 茶 堿（Theacrine，Tc），茶葉堿（theophylline，Tp），兒茶素（catechin，C），表兒茶素（epicatechin，EC），表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG），表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC），表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG），沒食子酸（gallic acid，GA），沒食子兒茶素（gallocatechin，GC），沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG），兒茶素沒食子酸酯（catechin gallate，CG）。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶多酚及游離氨基酸總量的測定

采用微波殺青法處理鮮葉，并放入烘箱以80℃烘干6 h。磨樣機磨碎后過80目篩，放入干燥器保存待測。依據GB/T 8313—2018，采用福林酚法測定茶多酚總量。依據GB/T 8314—2013，采用茚三酮法測定游離氨基酸總量。

1.3.2 嘌呤生物堿及兒茶素組分與含量測定

嘌呤生物堿：采用安捷倫C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱。流動相A為0.1%三氟乙酸水溶液，流動相B為甲醇，恒定梯度洗脫，即：0 ～ 40 min，流動相 B 為 10%。柱溫25℃，流速 1 mL/min，檢測波長 232 nm，上樣量10 μL，色譜峰如圖1(a)所示。

兒茶素：采用安捷倫 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱。流動相A為0.1%三氟乙酸水溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫（以流動相 B 的比例進行標注），即：0 ～ 8 min，8%；8 ～ 20 min，8% ～ 13%；20 ～ 25 min，13%～ 20%；25 ～ 30 min，20% ～ 25%；30 ～ 35 min，25% ～ 30%；35 ～ 40 min，30% ～ 35%；40 ～ 45 min，保持35%。柱溫38 ℃，流速0.8 mL/min，檢測波長278 nm，上樣量10 μL，色譜峰如圖1(b)所示。

2 結果與分析

2.1 茶多酚及游離氨基酸總量

茶多酚及游離氨基酸相關數據見表1。經測定，25份潮州野生茶樹資源的茶多酚總量在176.08 ～ 280.91 mg/g，平均含量為 227.19 mg/g；其中有3株茶樹的茶多酚總量超過250 mg/g，分別是11號（280.91 mg/g）、7號（264.23 mg/g）和3號（250.42 mg/g）。兒茶素是茶多酚的主體成分，25份潮州野生茶樹資源的兒茶素總量在 58.38 ～ 169.81 mg/g，平均含量為 111.70 mg/g。觀察圖1可知，2號、3號、7號和9號茶樹茶多酚總量較高而兒茶素含量較低，推測含有較高比重的黃酮或花色素類物質。

表1 茶多酚、兒茶素、游離氨基酸及相關數據Table 1 Tea polyphenols, catechins, free amino acids and related data

茶樹一芽二葉氨基酸總量一般在2% ～ 5%。本研究中游離氨基酸總量在2.0% ～ 2.9%，含量均較低，推測可能是因為采摘樣本成熟度高（一芽三葉），當年春季雨水偏少且升溫較快。游離氨基酸總量低可能使得潮州野生茶樹所制茶葉的鮮爽度等受到影響。

2.2 嘌呤生物堿組分及含量

1號、10號、11號、12號、13號、15號、16號、17號、19號、22號和25號茶樹均以咖啡堿為優勢生物堿，其中1號、10號、11號、16號和22號的咖啡堿含量超過40 mg/g。10號茶樹的咖啡堿含量達到56.64 mg/g，符合高咖啡堿（Cf ＞ 50 mg/g）茶樹資源的標準[4]，可為高咖啡堿品種的選育提供材料。

圖2 茶多酚及兒茶素總含量a. 茶多酚 b. 兒茶素Figure 2 Total content of tea polyphenols and catechinsa. tea polyphenols b. catechins

2號、3號、4號、5號、6號、7號、8號、9號、14號、18號、20號、21號、23號和24號茶樹均以可可堿為優勢生物堿，不含咖啡堿，可為選育無咖啡堿或低咖啡堿茶樹品種奠定基礎。目前尚未有高可可堿茶樹資源的統一標準，若以高咖啡堿資源標準為參照，則2號、4號、5號、7號和9號茶樹可被視為高可可堿茶樹資源。

觀察表2中可可堿與咖啡堿的數據可發現，以咖啡堿為主的資源可可堿含量很低，均不超過10 mg/g，其中有6份資源不超過3 mg/g；以可可堿為主的資源可可堿含量基本在40 mg/g以上。這可能是因為，在茶樹的咖啡堿合成通路中可可堿為咖啡堿的上游產物，推測此現象是茶樹的咖啡堿合成酶發生突變，失去N-1的催化能力[5]，無法將可可堿進一步催化生成咖啡堿，造成了可可堿的積累。

表2 嘌呤生物堿與兒茶素的組分及含量 （mg/g）Table 2 The composition and content of purine alkaloids and catechins （mg/g）

2.3 兒茶素組分及含量

如表1所示，以咖啡堿為主的資源兒茶素總量在 115.25 ～ 169.81 mg/g，以可可堿為主的資源兒茶素總量在 58.38 ～ 110.84 mg/g，以可可堿為主的茶樹資源，其兒茶素總量均低于以咖啡堿為主的資源。在酯型兒茶素方面，以可可堿為主的資源酯型兒茶素總量主要集中在60 ～70 mg/g；而以咖啡堿為主的資源除17號與19號茶樹外，均在90 mg/g以上，以可可堿為主的資源酯型兒茶素含量亦較低。在兩類兒茶素比重方面，以咖啡堿為主的資源與以可可堿為主的資源無明顯差異。

在25份潮州野生茶樹資源中，1號茶樹的EGCG含量接近10%，可作為高EGCG茶樹選育的材料[6]。在鮮葉EGCG和ECG有一定含量的基礎上，EGC含量與紅茶成茶中的茶黃素含量呈極顯著正相關[7]。EGC一般占茶葉干重的2%[8]，本研究中1號和25號茶樹的含量超過3%，有望成為高茶黃素優質紅茶新品種的育種材料。

此外，在以可可堿為主的資源中，EGCG的最高含量僅為32.55 mg/g（2號），明顯低于以咖啡堿為主的資源（43.54 ～ 96.86 mg/g）。同時，未檢測到咖啡堿的2號、3號、4號、5號、6號、7號、8號、9號、14號、18號、20號、21號、23號和24號茶樹，伴隨兒茶素EGC、ECG的缺失。EGCG含量低、兒茶素組分不全是此類茶樹資源的顯著特征。

3 討論

3.1 潮州野生茶樹資源的特性

咖啡堿為茶種（Camellia sinensis (L.) O.Ktze.）的優勢嘌呤生物堿，占茶葉干重的2% ～4%。以可可堿為優勢生物堿的茶種資源尚未見報道，但在其近緣植物中，‘毛葉茶’‘滇緬茶’‘禿房茶’（Camellia gymnogyna Chang）和‘紫果茶’（Camellia purpurea Chang）均以可可堿為優勢生物堿，含量分別在6.8%、0.5%、3.2%和2.9%附近[9-10]。在兒茶素單體方面，茶種的優勢兒茶素單體為EGCG，一般占茶葉干重的3% ～ 6%[11]。

在茶種近緣植物中，‘毛葉茶’的優勢兒茶素單體為GCG，占茶葉干重的5.2%；‘禿房茶’的優勢兒茶素單體為EGCG，占茶葉干重的2.8%；‘滇緬茶’的優勢兒茶素單體為EC，占茶葉干重的1.1%；‘厚軸茶’（Camellia crassicolumna Chang）的優勢兒茶素單體為EGC，占茶葉干重的1.57%；‘大理茶’（Camellia taliensis）的優勢兒茶素單體為ECG，占茶葉干重的3.7%[12]。其中‘厚軸茶’和‘大理茶’以咖啡堿為優勢生物堿。

參考以上研究，本研究中的25份野生茶樹資源主要分為兩類：

1號、10號、11號、12號、13號、15號、16號、17號、19號、22號和25號茶樹以咖啡堿為主（1.9% ～ 5.7%），幾乎不含可可堿。優勢兒茶素單體為 EGCG，含量在 43.54 ～ 96.89 mg/g，兒茶素單體從高到低依次為EGCG、GCG、GC、ECG、C、EGC、CG和EC。綜合生物堿及兒茶素特征，推測以咖啡堿為主的資源屬于茶種。

2號、3號、4號、5號、6號、7號、8號、9號、14號、18號、20號、21號、23號和24號茶樹以可可堿為主（3.0% ～ 5.6%），不含咖啡堿。優勢兒茶素為GCG，含量在20.99 ～ 42.21 mg/g，兒茶素單體從高到低依次為GCG、EGCG、C、GC、EC和CG，未檢測到EGC和ECG。在茶種近緣植物中，‘毛葉茶’以可可堿為優勢生物堿，GCG為優勢兒茶素單體。與‘毛葉茶’相比，普通茶種植物的可可堿及GCG含量很低，但二者的嘌呤生物堿及兒茶素特征較為一致。推測這種資源為茶種近緣植物或兩者的天然雜交種，具體分類學定位有待進一步研究。

此外，以可可堿為優勢生物堿并伴隨兒茶素單體缺失或含量極低的現象，在茶的近緣植物中有類似報道。根據Zeng等[13]的研究，‘厚軸 茶’（Camellia crassicolumna Chang） 存 在明顯的GC、C、GCG、CG缺失（未檢出），‘禿房茶’存在明顯的CG缺失且EGC、EC、ECG、CG的含量極低（不足1%）。茶樹近緣種在兒茶素及嘌呤生物堿的種類及含量上都與栽培茶種存在顯著差異。這種特質可能就是其所制茶葉風味表現不佳的原因之一。

3.2 以可可堿為主的潮州野生茶樹的風味特征

可可堿和咖啡堿都可以與TAS2R苦味受體家族成員結合[14-15]，使茶湯呈現苦味，但同時適量咖啡堿對茶氨酸的鮮味有增益效果，咖啡堿與多酚氧化物形成的絡合物可豐富茶湯風味（Yin et al., 2014）。兒茶素約占茶多酚總量的80%，占茶葉干重的8% ～ 26%，是茶葉的主體風味物質，兒茶素含量的高低決定著茶湯滋味的濃淡[16]。酯型兒茶素是茶湯苦味的主要來源，且其中EGCG和ECG的濃度與澀味高度相關[17]。氨基酸在茶湯中具有多種呈味特征，如：鮮、甜、酸、苦。谷氨酸和茶氨酸是茶湯中游離氨基酸的主體部分，主要呈現鮮味和甜味。

綜合分析，以可可堿為主的潮州野生茶樹兒茶素與氨基酸含量均較低，所制茶葉可能表現出滋味淡薄、苦味明顯、鮮甜感不足的特征。

4 結論

本試驗研究從25份潮州野生茶樹資源發掘出高咖啡堿資源1份、高可可堿資源5份、高EGCG茶樹資源1份及高EGC茶樹資源2份，可為相關茶樹品種的選育提供物質基礎。根據生物堿模式不同，可將25份資源分為以可可堿為主和以咖啡堿為主兩類。以可可堿為主的資源不含咖啡堿，優勢兒茶素單體為GCG并伴隨EGC和ECG的缺失，推測其為茶種近緣植物或兩者的天然雜交種，具體分類學定位有待進一步研究。同時，兒茶素與氨基酸含量低、兒茶素組分不全的特性可能導致所制茶葉滋味不佳。可可堿具有與咖啡堿類似的保健功效，如利尿、抗炎、促進血管舒張等，但對中樞神經的刺激作用較弱，不至于產生明顯的失眠、心悸等副作用。故在資源利用方面，其藥用價值應更具開發前景。