散茶曲小罐發酵在普洱熟茶中的應用研究

田海霞，孫婷婷，李 頌，馬 躍，劉海新，戴 申，翁慧瓊

1. 中茶科技（北京）有限公司，北京 102209；2. 云南中茶茶業有限公司，云南 昆明 650000

普洱熟茶是利用云南大葉種曬青毛茶經潮水、渥堆發酵、晾干、精制后得到的后發酵茶[1]。普洱熟茶渥堆發酵過程本質上是曬青毛茶在一定的溫濕度和含氧量的環境條件下，伴隨菌群的更替和代謝[2-3]，形成豐富的外源胞外酶并誘導激活茶葉內源酶，進而發生物質和能量的轉化，期間伴隨微生物對葉片的侵染作用[4]、各種酶促反應及美拉德反應，最終形成普洱熟茶的典型特征。渥堆發酵是普洱熟茶的特征性核心工序[5]，目前對普洱熟茶渥堆發酵工序的研究集中在茶青初始及過程中水分變化、渥堆高度、發酵進程的堆溫變化、人工翻堆次數及渥堆發酵進程中微生物菌群的變化分析與優勢菌株研究[6-9]。但優勢菌株通過人工干預來推動發酵進程進而影響發酵底物的香氣和滋味的研究較少，與自動化固態發酵裝備結合進行規模化產業應用推廣的研究仍處于空白[10-12]。本試驗研究將前期大量工藝應用研究中篩選的普洱傳統發酵優勢菌株進行重新組合，制備成散茶曲，引入小罐標準化發酵工藝，研究散茶曲對普洱熟茶發酵的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株來源：新黑曲霉（Aspergillus neoniger），保藏編號為CGMCC No.15883，從勐海地區傳統大堆發酵一翻料中分離篩選得到；琉球曲霉（Aspergillus luchuensis），保藏編號為CGMCC No.15663，從勐海地區傳統大堆發酵三翻料中分離篩選得到；魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii），保藏編號為CICC 1379，購于中國工業微生物菌種保藏中心；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），保藏編號為CGMCC No.15959，從傳統發酵的開溝起堆料及老茶中分離篩選得到。

試劑耗材：云南布朗產區大葉種曬青毛茶，購于中茶云南公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）和馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基（PDB），購于北京陸橋技術有限責任公司；超純水由實驗室自制，ThermoFisher F3型單道移液器；一次性培養皿、接種環等。

1.2 儀器與設備

蘇凈SW-CJ-2FD型超凈工作臺；上海一恒GRX-9013A型恒溫恒濕培養箱；ZEALWAY GR650R型高壓滅菌鍋；2834型水浴鍋；Mettler Toledo ME104型萬分之一天平；上海恒一DHG-9240A型電熱恒溫干燥箱；蔡司GR85DA型顯微鏡；Kylin-Bell VORTEX QL-902 型渦旋混合器；IKA RCT B S025 型加熱磁力攪拌器等。發酵小罐采用自主研發茶葉發酵專用罐，為食品級HP450J材質制作，發酵罐容積為4 L，濕茶填裝量為 1 ～ 1.5 kg，發酵小罐裝置見圖 1。

圖1 發酵小罐裝置圖Figure 1 fermentation small tank device diagram

1.3 試驗方法

1.3.1 散茶曲制備

以云南大葉種條茶為培養基質，將其滅菌后接入普洱茶分離篩選的優勢菌株[13-17]，分別為琉球曲霉(Aspergillus luchuensis)、新黑曲霉（Aspergillus neoniger)、魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的液體種子，經固態純種培養后形成散茶純種，按一定比例拼配后形成發酵用散茶曲，散茶曲活菌數≥108CFU/g。發酵用散茶曲拼配見表1。

表1 散茶曲種混合配方表Table 1 Mixed formula table of Loose tea

1.3.2 散茶曲發酵普洱熟茶方法

按照圖2的工藝流程，取五級曬青毛茶共9份，每份100 kg，各加水42 kg，充分拌勻后靜置20 min，取其中8份分別按表1播撒編號1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#和8#的散茶曲，最后1份不播撒散茶曲作為對照（CK）樣；每份播撒量為干茶的10%即10 kg，充分拌勻后靜置20 min，取樣測水分并做記錄，使茶葉的含水量控制在33% ～ 35%；復水后的處理樣用小罐封裝，每罐裝量為1.2 kg濕茶，每個處理裝130罐，獨立碼放形成兩個堆垛。將發酵堆垛按順序碼放在發酵室進行發酵，按表2的要求設置培養室的環境參數，發酵全程不補水、不出料、不翻動，一次性培養35 d后結束發酵；結束發酵的堆垛按處理標記，將物料從小罐中倒出并解散后進入干燥房干燥處理。

圖2 散茶曲小罐發酵普洱熟茶工藝流程Figure 2 Process flow of loose tea koji fermenting Pu'er ripe tea

表2 發酵室環境條件Table 2 Fermentation conditions

1.3.3 茶樣感官評定

發酵過程需要進行兩次取樣審評，一次在發酵結束后，取樣開湯，主要評價湯色和葉底狀態是否達到熟茶標準；第二次是干燥后，按茶葉審評標準進行外形和內質審評，綜合打分評價發酵效果。

1.3.4 茶樣理化檢測

發酵結束后的各處理樣分別抽取2 kg進行干燥，將水分統一調整至15%，分別進行茶湯固形物、茶多酚、茶色素、pH值、氨基酸態氮和菌落總數測定。

水分測定方法參照 GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》測定；感官審評參照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》進行；茶湯固形物檢測方法參照GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》中可溶性固形物測定方法（折光計法）；茶多酚檢測方法參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素含量的檢測方法》；茶褐素含量測定參照《茶學綜合實驗》[18]；pH值檢測方法參照《不同茶類茶湯pH值的研究》[19]；氨基酸態氮檢測方法參照GB 5009.235—2016第一種；菌落總數參照GB4789.2—2016《食品微生物菌落總數的測定》。

2 結果與分析

2.1 不同處理茶樣感官評價結果

添加散茶曲的不同處理綜合評分排名為：7#、8#、6#、5#、1#、2#、3#、4# 和 CK#（ 表3）。其中，接入散茶曲處理的發酵效果均優于不添加散茶曲，接入混合散茶曲的茶樣感官品質優于接入單菌株散茶曲的茶樣。在接入混合散茶曲處理的審評結果中，5#處理的發酵料稍有結塊，香氣中稍帶霉味和水汽感；6#處理的發酵料外形松散，焦甜香高揚，湯色明亮，滋味略帶苦，葉底稍硬（發酵稍過）；7#處理的發酵料外形松散，干茶紅潤度好，香氣高揚，滋味醇厚，葉底柔軟有彈性；8#處理的發酵料外形松散，干茶紅潤度好，香氣高揚，滋味濃醇，湯色稍渾濁。綜合審評結果可看出：隨著琉球曲霉添加比例的上升，茶葉外形的松散度和干茶的紅潤度明顯變好，香氣高揚，但湯色逐步變渾濁；隨著新黑曲霉添加比例的上升，新黑曲霉對茶湯的透亮度有明顯的改善作用，但發酵料容易結塊（圖3）。因此，新黑曲霉和琉球曲霉對發酵料感官審評影響明顯，推斷其在發酵進程中起主導作用，酵母菌和枯草芽孢桿菌對發酵料的感官品質影響表現不突出，推斷其在發酵進程中起輔助作用。

圖3 不同處理的干茶Figure 3 Dried tea under different treatments

表3 不同處理發酵茶樣感官評價結果Table 3 Sensory evaluation different experimental fermented tea samples

2.2 不同處理茶樣發酵成熟度變化

從圖4可看出：1#處理和5#處理在相同發酵時間內發酵成熟度最高，可達8成熟；6#處理和7#處理的成熟度為7成熟，其它接散茶曲的處理和CK對照樣的成熟度為6成熟。結合審評結果來看：成熟度達到8成時，葉底稍硬略有腐爛，發酵稍過；成熟度達到7成時，感官品質更佳；而成熟度為6成時，苦底稍重，湯色的透亮度下降。從成熟度表現來看，新黑曲霉可明顯加速發酵進程，隨著新黑曲霉散茶曲種添加比例的下降，發酵的成熟度也隨之下降。

圖4 不同處理樣發酵料發酵度Figure 4 Different processing sample fermentation material fermentation degree

2.3 不同處理茶樣理化指標變化

從表4可看出，不添加散茶曲種的對照CK樣茶色素、pH值、氨基酸態氮和固形物的含量均明顯低于同發酵條件下的添加散茶曲的處理樣。混合散茶曲處理樣中，隨著新黑曲霉添加比例的降低，茶多酚含量逐步升高，茶色素、pH值、氨基態氮和固形物含量變化不大。鑒于熟茶后期存儲轉化空間的考慮，兼顧感官審評結果，優選茶多酚保留大的處理，因此以7#處理最佳。

表4 不同處理發酵茶樣理化指標檢測結果Table 4 Different experimental fermented tea sample physical and chemical indicators testing table

2.4 不同處理茶樣發酵過程中微生物菌落的變化

從表5可看出，CK、2#、3#、4#和8#等五個處理的霉菌菌落數量過少，第一階段結束后菌絲漲勢弱，作用不充分，致使第二階段濕熱作用時發酵罐內部水分散失過快，接入的酵母菌和芽孢桿菌活菌數急速下降，導致發酵不充分，使發酵結束后的物料湯色渾濁，成熟度稍低。1#和5#處理，第一階段霉菌生長過多，微生物呼吸產生大量水分迅速累計至發酵罐底部，出現底部積水，致使第二階段濕熱發酵過快，底部出現輕微碳化，導致發酵后的物料結塊嚴重，白色菌絲過多，湯色濃度不夠，葉底碳化嚴重，茶湯苦底重，香氣沉悶水汽大。6#和7#處理，第一發酵階段菌落數量適中，發酵菌絲滿布且均勻，成團但不腐爛，底部無積水；第二階段的濕熱發酵均勻充分，干茶紅潤，發酵成熟度適中；第三階段養瓶期間出現甜醇感和梅子香，葉底柔軟不腐爛，香氣高揚。綜上微生物菌落數的表現看，發酵前期的霉菌菌落數需要快速達到108數量級以上，菌絲要充分侵染茶葉，使茶葉液泡中的多酚氧化酶充分釋放，同時各類微生物要充分釋放胞外酶，為后續濕熱作用提供酶活動力[20]。可見，本試驗中5#、6#和7#處理的添加量和配比可達到上述效果。

表5 不同處理發酵過程中微生物菌落變化表Table 5 Changes of microbial colonies in different experimental groups during fermentation

3 討論與結論

通過接種不同配比的散茶曲進行小罐普洱熟茶發酵實驗，綜合分析了不同處理發酵料感官品質特征、理化指標變化趨勢及發酵進程中微生物菌落數量的變化情況。從不同處理樣的感官審評結果可知：當魯氏酵母菌和枯草芽孢桿菌的添加比例固定時，新黑曲霉和琉球曲霉的添加比例在3∶4時發酵的狀態最佳，可兼顧滋味、香氣、湯色和外形，有效降低茶葉發酵過程結塊現象，降低新堆的霉味和水悶氣，提升茶葉品質，出現特征性的梅子香氣。從不同處理樣的理化檢測數據可看出：按比例添加散茶曲種發酵普洱熟茶，茶色素含量明顯提升，茶色素對調節人體腸道菌群有很好的輔助作用[21-23]；茶湯pH值明顯升高，達到人體液體[24]的弱堿性水平；茶湯固形物含量明顯增加，提升茶湯的醇厚度；茶湯中氨基態氮含量提升，使茶湯的鮮甜感更突顯。從不同微生物的發酵表現來看：新黑曲霉對普洱熟茶發酵作用力最強，可加速發酵進程，但新黑曲霉發酵使茶多酚消耗過大，影響熟茶后期存放轉化空間，且發酵料容易積水結塊，使最終產品霉味和水悶氣重。琉球曲霉作用過于溫和，對茶葉的侵染力較弱，致使后期發酵不充分導致茶湯渾濁，但發酵料香氣高揚，外形完整，干茶紅潤不結塊。魯氏酵母菌和枯草芽孢桿菌在第一階段擴增繁殖期很容易被環境及茶葉自帶的微生物菌群壓制，對發酵進程和發酵效果的表現并不明顯。

綜上所述，接入散茶曲可明顯加快普洱熟茶的發酵進程。其中，新黑曲霉對發酵速度和湯色的亮度貢獻最大，琉球曲霉對外形的紅潤度和松散度影響明顯，魯氏酵母菌和枯草芽孢桿菌對后熟過程中風味的醇化和滋味的豐富度有輔助作用。通過四種微生物配比的優化實驗發現，當新黑曲霉：琉球曲霉：魯氏酵母：枯草芽孢桿菌配比為3∶4∶2∶1時發酵的效果最佳，其發酵成熟度為7成，茶湯中的茶多酚和茶色素的比例適中，更有利于后期陳化轉化，此時的茶湯pH值、氨基酸態氮和水溶性固形物的含量也較高，茶湯滋味更飽滿豐富。因此，適當的散茶曲添加比例可加速發酵進程，優化發酵料感官品質，提升發酵料的功能性理化成分含量。本試驗對小罐標準化熟茶的推廣和應用具有指導作用，可通過微生物優勢菌株的干預和發酵控制條件改變[24]，從而控制發酵成熟度和產品風味特色，優化功能性理化成分指標，進一步推動普洱熟茶發酵的工業化水平，提升產品的健康屬性，打造產品的差異化特性。

微生物發酵可使曬青毛茶重塑，不同的微生物配比配合發酵工藝的適當調整可在一定程度上實現差異化發酵。本試驗引入的小罐發酵技術是人工散茶曲干預研究普洱熟茶發酵的新載體，每個發酵小罐可實現內部微環境的相對獨立，同一培養室可同時嘗試多種微生物的組合搭配，而相互間不受影響，工業化操作的便利性也更好。

小罐發酵技術是傳統熟茶發酵工藝技術的升級，小罐發酵的本質是把大堆料進行分割，變成若干個獨立單元，通過外置自動化裝備，實現發酵過程的自動化和連續化作業，每個發酵罐單獨控制，獨立完成發酵，每個培養房可看作一個發酵大堆，可容納 10 ～ 20 t的發酵小罐料，發酵過程中通過調整培養房的環境條件，滿足發酵小罐的溫濕度要求，小罐罐心溫度和環境溫度可控制在2℃ ～ 3℃的溫差范圍，因此發酵全程不倒罐、不出罐，一次性完成發酵，實現每個小罐罐體內部的環境相對封閉，且能充分保障發酵的均勻度和底物茶葉條索的完整性。

本實驗在小罐發酵工藝的基礎上引入散茶曲，研究了散茶曲的制備方法，最優發酵組合及散茶曲對發酵料品質的影響。但散茶曲在發酵進程中如何對底物茶葉發揮作用的研究還不夠深入，后續研究中，可重點關注小罐發酵過程中曲霉類對底物的影響，發酵環境和微生物之間的對應關系及發酵過程中微生物、底物和環境三者相互作用的動態變化過程，實現小罐發酵過程的精準控制和差異化產品開發。這對普洱熟茶發酵技術的進一步提升和品質把控有著深遠的影響，也對整個普洱熟茶發酵行業進一步工業化轉型升級提供理論基礎。