基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑 防治宮腔粘連的作用機(jī)制

張永青，余惠，季曉黎

（成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610072）

0 引言

宮腔粘連也被稱為Asherman綜合征，其由妊娠或其他因素引起的子宮損傷，導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜基底層受損，引起子宮內(nèi)膜纖維化和宮腔粘連及變形[1]。其臨床癥狀主要為月經(jīng)量減少或閉經(jīng)、不孕及流產(chǎn)，對(duì)患者的心理健康和生育功能造成嚴(yán)重影響[2,3]。宮腔鏡為目前治療宮腔粘連的首選治療方式[4]，是目前治療IUA的主要手段，宮腔鏡下粘連分離術(shù)主要分為電切和冷刀。電切術(shù)是臨床廣泛應(yīng)用的技術(shù)手段，它能有效分離粘連組織，但其電熱量容易損傷子宮內(nèi)膜，術(shù)后容易復(fù)粘[5,6,7,8]。因此，如何預(yù)防宮腔粘連分離術(shù)后再粘連的發(fā)生，解決患者月經(jīng)過少及妊娠需求是目前臨床的難題也是亟需解決的問題之一。

補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑是成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，全方以肝腎同調(diào)為指導(dǎo)共奏補(bǔ)腎益精、益氣養(yǎng)血、調(diào)經(jīng)助孕之效。現(xiàn)代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[9]及大量臨床實(shí)例觀察[10]表明補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑防治宮腔粘連分粘術(shù)后繼發(fā)月經(jīng)過少、改善婦女的生殖功能有確切的療效，但其具體機(jī)制尚未明了。本研究欲利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從整體出發(fā)，系統(tǒng)性地探討補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑治療IUA的潛在機(jī)制，以期為擴(kuò)大本方在臨床的應(yīng)用并進(jìn)一步行科學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑化學(xué)成分和靶點(diǎn)篩選

登錄TCMSP[11]依次輸入補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑組方成分,如“黨參”，以生物利用度(OB)＞30%且類藥性(DL)＞0.18為條件,篩選出補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑中利用度及活性偏高的有效活性成分。應(yīng)用通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(UniProt)[12]，將獲得的藥物活性成分靶標(biāo)進(jìn)行通用名稱注釋。

1.2 宮腔粘連相關(guān)靶點(diǎn)篩選

通過 GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫，輸入關(guān)鍵詞 “Intrauterine adhesions”，收集IUA相關(guān)靶點(diǎn)，整理后建立IUA相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.3 補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑活性成分靶標(biāo)與宮腔粘連共同作用靶標(biāo)的獲取

運(yùn)用Venny2.1軟件繪制補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑活性成分與宮腔粘連相關(guān)靶標(biāo)得到韋恩圖，該圖中相交集靶標(biāo)，就是二者共同作用靶標(biāo)。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將通過韋恩圖取交集得到的補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑活性成分靶標(biāo)與宮腔粘連共同作用靶標(biāo)上傳至STRING[13]數(shù)據(jù)庫,物種設(shè)為”Homo sapiens”，將“minimum required interaction score”設(shè)為“highest confidence(0.900)”，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。即可得到靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，導(dǎo)出其TSV格式圖片。

1.5 中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將PPI 網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入 Cytoscape3.7.2[14]軟件，構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”圖，藥物活性成分和作用靶點(diǎn) 以“節(jié)點(diǎn)”表示，節(jié)點(diǎn)之間的相互作用以“邊”表示。按照鏈接靶標(biāo)數(shù)量降序排列，鏈接的靶點(diǎn)數(shù)越多表明與該靶點(diǎn)作用就越大[15]。由此篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)可作為接下來分子對(duì)接的對(duì)象。

1.6 GO和KEGG富集分析

借助R語言利用Bioconductor[16]軟件，將補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑有效活性成分與IUA共同作用的靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，并可視化。

1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證

將1.5中得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)輸入PDB[17]數(shù)據(jù)庫，下載關(guān)鍵靶點(diǎn)的3D蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入PyMol 2.3.4軟件[18]對(duì)關(guān)鍵蛋白進(jìn)行處理后，保存后導(dǎo)入 Autodock 4.2.6 軟件[19]再次進(jìn)行處理。在 TCMSP 數(shù)據(jù)庫中下載對(duì)接成分，保存為“mol2”結(jié)構(gòu)，利用 Autodock 進(jìn)行核心成分的分子對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑活性化學(xué)成分和相關(guān)靶點(diǎn)

借助TCMSP數(shù)據(jù)庫,最終篩選出補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑組方的活性成分2056個(gè)，去除重復(fù)項(xiàng)后剩余252個(gè)，按OB大小降序排列，選取前15個(gè)有效活性成分。

2.2 IUA靶點(diǎn)基因篩選

通過 GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索到IUA相關(guān)靶點(diǎn)3246個(gè)。

2.3 補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑對(duì)IUA作用靶點(diǎn)篩選

將去除重復(fù)項(xiàng)后的252個(gè)補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑活性成份靶標(biāo)與IUA相關(guān)靶標(biāo) 3246個(gè)靶點(diǎn)取交集，得到151個(gè)交集基因，交集基因的 Venn 圖（見圖 1）。

圖1 補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑-IUA 交集基因 Venn 圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

登錄STRING數(shù)據(jù)庫，將通過韋恩圖取交集得到的補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑活性成分靶標(biāo)與宮腔粘連共同作用靶標(biāo)上傳，得到靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（如圖2）。

圖2 共同作用靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.5 中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將PPI 網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建圖3。其中最外圈節(jié)點(diǎn)代表二者共同作用靶標(biāo)，內(nèi)圈節(jié)點(diǎn)代表活性成分，節(jié)點(diǎn)之間的連線代表二者的互作關(guān)系。按照鏈接靶標(biāo)數(shù)量降序排列，補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑治療IUA前4位的活性成分主要有槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇；同理可得補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑治療IUA作用的前6位主要靶標(biāo)為MAPK1、RELA、STAT3、JUN、EGFR、MMP9。

圖3 補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑治療宮腔粘連活性成分-共同靶標(biāo)互作網(wǎng)絡(luò)

2.6 GO功能富集分析及KEGG通路的富集分析

借助R語言利用Bioconductor軟件，得到GO分析結(jié)果，選取前20位以氣泡圖(見圖4)形式進(jìn)行可視化。由圖可見補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑治療IUA主要參與nuclear receptor activity、ligand-activated transcription factor activity、cytokine activity等多方面的生物過程。同理得到KEGG分析結(jié)果(見圖5)，可見補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑治療IUA作用的通路有Lipid and atherosclerosis、Fluid shear stress and atherosclerosis、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Prostate cancer、低氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路等。

圖4 補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑治療宮腔粘連的前20位GO功能富集分析結(jié)果

圖5 補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑治療宮腔粘連的前20位KEGG通路富集分析結(jié)果

2.7 分子對(duì)接結(jié)果

為討論網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，我們?cè)诰W(wǎng)絡(luò)圖中選取degree較高的前4個(gè)成分包括槲皮素、木樨草素、山柰酚、β-谷甾醇作為對(duì)接藥效成分，選取dgree較高的靶點(diǎn)MAPK1、STAT3、VEGFA、JUN作為對(duì)接靶點(diǎn)通過Autodock 4.2.6軟件分別進(jìn)行分子對(duì)接。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)合能小于-5.0 kcal/mol 是分子對(duì)接時(shí)配體和受體穩(wěn)定結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合能越低分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性越高[20]，親和力越強(qiáng)。如表2所示，成分與靶點(diǎn)均具有一定的親和力，其中木樨草素與STAT3結(jié)合具有良好穩(wěn)定性，槲皮素與STAT3有良好的穩(wěn)定性，其余大多數(shù)藥效成分能與對(duì)接靶點(diǎn)構(gòu)成氫鍵增強(qiáng)穩(wěn)定性。對(duì)上述對(duì)接結(jié)果利用 PyMol 2.3.4軟件繪圖(圖6)，以上分子對(duì)接結(jié)果表明，槲皮素、木樨草素、山柰酚、β-谷甾醇成分是補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑治療宮腔粘連的潛在活性成分，可能通過MAPK1、STAT3、VEGFA、JUN這些靶點(diǎn)發(fā)揮作用。

表2 核心活性化合物與核心蛋白最低結(jié)合能（單位：kcal/mol）

圖6 蛋白對(duì)接構(gòu)象

3 討論

宮腔鏡宮腔粘連分離術(shù)(TCRA)是目前治療本病主要方法，術(shù)后一般為促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)多采用雌激素治療以期恢復(fù)月經(jīng)，但雌激素治療作用的發(fā)揮必須是建立在有足夠殘留內(nèi)膜的基礎(chǔ)之上，若宮腔粘連的程度較重、子宮內(nèi)膜損傷的面積較大，即便是術(shù)后使用雌激素也是很難促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生修復(fù)，恢復(fù)月經(jīng)和生育能力，預(yù)防再粘連，達(dá)到有效的治療效果[21]。

中醫(yī)實(shí)則無“宮腔粘連”這一病名的記載，現(xiàn)依其主要臨床表現(xiàn)將其歸屬于“經(jīng)水過少”“不孕”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎在女子的經(jīng)、帶、胎、產(chǎn)中擔(dān)任著不可取代的作用，正如《傅青主女科》載：“經(jīng)本于腎”。本病多起于流產(chǎn)刀刃創(chuàng)傷，損耗腎精，沖任血海空虛，氣血運(yùn)行不暢，瘀血阻絡(luò)故“腎虛血瘀”為該病最主要病機(jī)。補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑是成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，以參芪圣愈五子湯為基礎(chǔ)組方旨在補(bǔ)氣健脾、益精養(yǎng)血調(diào)經(jīng)[22]。將我院婦科門診就診的108例宮腔粘連分粘術(shù)后月經(jīng)過少患者，隨機(jī)分為兩組，治療組為補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑組，對(duì)照組為四物合劑組，兩組治療后總有效率分別為87.0%、70.4%，且兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。該臨床觀察表明，補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑治療宮腔粘連分粘術(shù)后月經(jīng)過少安全可靠且療效確切。但針對(duì)宮腔粘連患者宮腔分粘術(shù)后反復(fù)粘連，補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑如何彌補(bǔ)子宮內(nèi)膜修復(fù)困難、改善月經(jīng)過少癥狀具體過程的這一難題，成為了亟待研究清楚的問題。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析表明補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑防治IUA是一個(gè)多成分、多靶點(diǎn)、多通路的綜合過程。篩選得到補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑排名靠前的有效成分包括槲皮素、木樨草素、山奈酚、β-谷固醇。現(xiàn)代研究也表明，槲皮素可恢復(fù)Treg/Th17的平衡從而帶有抗炎和調(diào)節(jié)免疫的作用[23]。β-谷甾醇通過降低促炎因子和環(huán)氧化酶COX-2的水平，也具備一定的抗炎作用[24]。山奈酚的抗炎活性在體內(nèi)和體外均有發(fā)揮。一些研究表明山奈酚通過抑制核因子 NF-κB活性從而抑制促炎細(xì)胞因子、趨化因子和酶的表達(dá)。木樨草素通過在體外分別通過抑制信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT3)來降低炎癥反應(yīng)[25]。IL-17信號(hào)通路多通過介導(dǎo)炎性因子的趨化、脫顆粒以及細(xì)胞內(nèi)包涵趨化因子受體的粘著分子(稱為整合素)的活性變化，涵蓋許多信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)(如MAP激酶途徑)積極參與炎癥反應(yīng)[26]。大量研究表明，氧化應(yīng)激在與女性生殖健康相關(guān)的婦科疾病如不孕癥、反復(fù)流產(chǎn)等的發(fā)生發(fā)展過程扮演著不可或缺的角色[27]。NF-κB參與氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞因子刺激等多種細(xì)胞生理過程，是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子[28]。研究表明，IUA 患者子宮內(nèi)膜組織中 NF-κB 表達(dá)水平明顯偏高，這也在一定程度上證明其與子宮粘連的發(fā)生和程度具有相關(guān)性[29]。

補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑治療宮腔粘連可能通過槲皮素、木樨草素等多化學(xué)活性成分，作用于MAPK1、STAT3、VEGFA、MMP9、JUN及 IL-17通路和TNF等信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)控nuclear receptor activity、ligandactivated transcription factor activity、cytokine activity等生物過程，通過 Lipid and atherosclerosis、Fluid shear stress and atherosclerosis、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Prostate cancer、高級(jí)糖化終產(chǎn)物及其受體(AGE-RAGE)、低氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(TNF)等信號(hào)通路發(fā)揮抗炎、抗氧化、抑制新生血管生成、促進(jìn)多種膠原及非膠原成分降解抗纖維化而防治IUA。表明補(bǔ)益調(diào)經(jīng)合劑在防治IUA的過程中具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的優(yōu)勢(shì)，為日后宮腔分粘術(shù)后及時(shí)使用中醫(yī)藥介入治療，促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)，改善月經(jīng)過少及妊娠結(jié)局提供了有效的理論指導(dǎo)。