富于淋巴細胞型乳腺癌中PD-L1和CD8+TILs的表達及臨床意義

楊月 張會芳 陳妙玲 韓玉貞

濱州醫學院附屬醫院病理科 256600

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，且近年來其發病率和病死率仍在不斷增加［1］。免疫治療是繼手術、放化療等治療之外新興的治療手段，程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）是免疫治療的重要靶點，PD-L1通過與淋巴細胞，主要為CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）表面程序性死亡受體-1（programmed death-1，PD-1）結合發揮其免疫抑制作用。近年來有關PD-L1和CD8+TILs在乳腺癌中的研究較多，但結果很不一致［2-6］。由于大多數乳腺癌TILs較少，而PD-L1的免疫抑制作用是以腫瘤淋巴細胞浸潤為前提［7］，這可能是研究結果不一致的原因之一。富于淋巴細胞型乳腺癌（lymphocyte-predominant breast cancer，LPBC）是一類富含淋巴細胞的乳腺癌，且瘤內和間質含有豐富的CD8+TILs，以LPBC為研究對象能更好地探討PD-L1和CD8+TILs表達之間的關系。為此，本研究探討LPBC中PD-L1和CD8+TILs的表達與臨床病理特征及預后的關系。

資料與方法

1、資料

選取濱州醫學院附屬醫院病理科2011年1月至2018年12月有完整臨床病理資料的LPBC 60例，包括年齡、腫塊大小、淋巴結狀態、組織學分級和Ki-67增殖指數。由2名病理醫師參照國際TILs工作組2014年提出的評估標準［8］對TILs進行評估，LPBC定義為乳腺癌間質TILs≥50%（圖1A）。納入對象均為女性，在術前均未接受過治療。通過電話或查詢病歷對LPBC患者進行術后隨訪，時間截止至2021年12月或患者死亡，中位隨訪時間78個月（22～127個月）。

2、納入和排除標準

納入標準：⑴入組患者均診斷為浸潤性導管癌，并由2名病理醫師參照相關標準評估為LPBC；⑵入組患者均具有完整的臨床病理資料，包括年齡、腫塊大小、淋巴結狀態、組織學分級和Ki-67增殖指數；⑶LPBC試驗標本均為手術切除大標本；⑷入組患者術前均未進行任何治療，包括新輔助放、化療，靶向治療，內分泌治療。排除標準：⑴病理及臨床資料不完整的患者；⑵乳腺穿刺標本；⑶其他部位的惡性腫瘤轉移到乳腺的患者；⑷術前進行過治療，包括新輔助放、化療，靶向治療，內分泌治療。

3、方法與試劑

應用免疫組化EnVision法染色。用10%中性福爾馬林溶液對標本進行固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，常規烤片、脫蠟、水化處理后，采用EDTA抗原修復液修復，3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶活性，滴加PD-L1（SP142，1∶50）、CD8一抗37℃放置2 h后棄去，滴加酶標山羊抗小鼠/兔免疫球蛋白（Ig）G聚合物二抗，37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，脫水透明，中性樹脂封片。用扁桃體組織作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。一抗PD-L1購自美國Abcam公司，CD8、二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。LEICA EG1160包埋機、LEICA RM2245切片機均購自德國LEICA公司，漂片烘片儀購自杭州中威電子制造，37℃恒溫箱購自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

4、結果判讀

⑴PD-L1陽性判讀標準：PD-L1陽性定位于細胞膜或細胞質（圖1B、C），任何強度PD-L1染色的腫瘤細胞（tumor cell，TC）或免疫細胞（immune cell，IC）為陽性細胞，分別記錄陽性TC和IC在腫瘤細胞巢和腫瘤周圍間質中所占的百分比，≥1%定義為陽性，＜1%為陰性［9］。⑵CD8判讀標準：CD8陽性著色定位于為細胞膜或細胞質（圖1D），接觸或位于腫瘤細胞巢內的淋巴細胞定義為iTILs，而間質區域內的淋巴細胞被定義為sTILs，不包括導管原位癌和正常乳腺組織周圍間質TILs。⑶CD8+iTILs和CD8+sTILs的判讀標準：低倍鏡下觀察全片，排除熱點區域，選取5個高倍視野（400×）并用CellSens Entry軟件進行閱片，用多邊形工具分別勾勒出腫瘤細胞巢和間質區域的面積，分別計數腫瘤細胞巢和間質區域中CD8+細胞數，CD8+TILs的密度以陽性細胞數/mm2表示。

圖1 A：富于淋巴細胞型乳腺癌，sTILs≥50%（HE染色200×）；B：PD-L1在 腫 瘤 細 胞 中 呈 陽 性（EnVision法200×）；C：PD-L1在免疫細胞中呈陽性（EnVision法200×）；D：CD8在間質和瘤內Tils中的表達（EnVision法100×）

5、統計學分析

采用SPSS 25.0統計軟件對數據進行分析。采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗分析LPBC中PD-L1和CD8+TILs表達與臨床病理特征之間的關系，采用Spearman秩相關檢驗分析PD-L1和CD8+TILs表達的相關性，采用Kaplan-Meier法進行生存分析并行Log-Rank檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1、LPBC患者的臨床病理特征

本文共篩選出LPBC 60例，患者均為女性，中位年齡51歲（29～71歲），腫塊中位直徑為2.5 cm（1.5～6.5 cm），淋巴結轉移率40.0%（24/60）。組織學類型均為浸潤性導管癌，其中組織學分級Ⅰ級0例，組織學分級Ⅱ級42例，組織學分級Ⅲ級18例。60例LPBC患者中位隨訪時間為78個月（22～127個月），在隨訪期間有4例患者復發（6.7%）、3例患者死亡（5.0%）。

2、TC和IC中PD-L1的表達與LPBC臨床病理特征的關系

PD-L1在腫瘤細胞中的陽性表達率為26.7%（16/60），PD-L1在免疫細胞中的陽性表達率為73.3%（44/60），總PD-L1陽性表達率為81.7%（49/60）。PD-L1在腫瘤細胞中的表達與組織學分級有關（P=0.041），與年齡、腫塊大小、有無淋巴結轉移、Ki-67均無關（均P>0.05）。PD-L1在免疫細胞中的表達與腫塊大小（P=0.004）、Ki-67有關（P=0.001），與年齡、組織學分級、有無淋巴結轉移均無關（均P>0.05）。見表1。

表1 PD-L1與60例LPBC患者臨床病理特征的關系

3、不同部位CD8+TILs與LPBC患者臨床病理特征的關系

本研究CD8+TILs檢測數值：CD8+sTILs中位數為807（295～2 454），CD8+iTILs中位數為108（0～634）；以中位數為臨界值分為低密度組和高密度組。CD8+sTILs和CD8+iTILs的表達與年齡、腫塊大小、有無淋巴結轉移、組織學分級、Ki-67差異均無統計學意義（均P>0.05）。見表2。

表2 不同部位CD8+TILs與60例LPBC患者臨床病理特征的關系

4、LPBC中PD-L1和CD8+TILs的相關性分析

腫瘤細胞中PD-L1的表達與CD8+iTILs的表達呈正相關（rs=0.301，P=0.019），免 疫 細 胞 中PD-L1的 表 達 與CD8+sTILs的表 達 無明 顯 相關 性（rs=-0.155，P=0.239），見圖2。

圖2 60例LPBC中PD-L1和CD8+TILs的相關性分析。A：腫瘤細胞中PD-L1和CD8+iTILs表達的相關性；B：免疫細胞中PD-L1和CD8+sTILs表達的相關性

5、PD-L1和CD8+TILs的表達對預后的影響

腫瘤和間質PD-L1表達與患者的無瘤生存期（disease free survival，DFS）和總生存期（overall survival，OS）均無顯著相關性（均P>0.05）。CD8+sTILs高密度組與較長的DFS相關（P=0.037，圖3A），CD8+sTILs的表達與OS無顯著相關性（P=0.084，圖3B）；CD8+iTILs高密度組與較短的DFS相關（P=0.042，圖3C），CD8+iTILs的表達與OS無顯著相關性（P=0.076，圖3D）。

圖3 60例LPBC患者的Kaplan-Meier生存曲線。A：不同密度CD8+sTILs與無瘤生存期的關系；B：不同密度CD8+sTILs與總生存期的關系；C：不同密度CD8+iTILs與無瘤生存期的關系；D：不同密度CD8+iTILs與總生存期的關系

討 論

腫瘤微環境包括免疫細胞、腫瘤相關成纖維細胞、細胞外基質等間質成分，乳腺癌細胞和間質細胞之間復雜的相互作用，在乳腺癌的發生發展中發揮著重要作用，并因其具有潛在的治療靶點而倍受關注［2］。許多研究表明，sTILs密度高的患者預后較好，TILs可作為判斷乳腺癌預后的指標，其中CD8+TILs在殺滅癌細胞方面發揮著重要作用［10］。腫瘤浸潤淋巴細胞按照所處的部位不同分為間質浸潤淋巴細胞和瘤內浸潤淋巴細胞。Catacchio等［11］研究發現，總CD8+T細胞與DFS無顯著相關性，而CD8+iTILs高表達的患者顯示出更差的5年DFS，CD8+sTILs高表達的患者顯示出更好的5年DFS。Chen等［12］研 究 顯 示，淋 巴 結 陰 性 乳 腺 癌 中CD8+iTILs高表達與DFS和OS的改善有關。Liu等［13］對3 403例浸潤性乳腺癌的研究發現，32.4%的患者每0.6 mm直徑的組織芯片至少有1個CD8+iTIL，60.6%的患者至少有1個CD8+sTIL；由此看出，非LPBC患者CD8+TILs數量較少，尤其是CD8+iTILs數量更少，經常被研究者們忽略。iTILs與腫瘤細胞直接接觸，可以更好地發揮腫瘤免疫作用。本文選取的是富于TILs的一類乳腺癌，能夠更好地反映瘤內和間質CD8+TILs與預后的關系。本研究顯示CD8+sTILs高表達患者具有更好的DFS，而CD8+iTILs高表達組顯示更差的DFS，提示不同部位CD8+TILs對乳腺癌有不同的預測預后作用。本研究還發現腫瘤細胞PD-L1表達與CD8+iTILs表達呈正相關，腫瘤細胞PD-L1抑制了CD8+iTILs的腫瘤免疫作用，這可能是CD8+iTILs高表達患者預后差的原因。

PD-1/PD-L1免疫檢查點通路是誘導乳腺癌免疫逃逸的重要機制之一，PD-L1與PD-1結合可抑制T淋巴細胞的激活、增殖和細胞毒性細胞因子的分泌［14］。近期美國食品藥品監督管理局（FDA）批準阿替利珠單抗（atezolizumab）聯合化療（abraxane，紫杉醇）用于治療PD-L1陽性的局部晚期或轉移的三陰性乳腺癌（TNBC）患者［15］。一項基于2 500例乳腺癌的meta分析顯示PD-L1陽性率在21%～56%范圍內［16］。本研究顯示PD-L1在免疫細胞中的表達顯著高于腫瘤細胞中的表達，這與大多數研究結果一致［6，17］，然而PD-L1在LPBC中的總陽性表達率高達81.7%。PD-L1在LPBC中高表達可能與高浸潤性TILs介導的適應性免疫反應有關，誘導腫瘤細胞表達PD-L1發揮免疫抑制作用。有研究表明，在所有類型的乳腺癌中，較短的OS和PD-L1表達之間存在關聯［18］；但也有研究顯示，在TNBC中，PD-L1陽性患者預后更好［19］。Huang等［20］研究發現TC中PD-L1的表達與大直徑腫塊、高組織學分級、高Ki-67、ER和PR陰性相關。Calik等［21］研究發現，在結直腸癌患者中腫瘤細胞PD-L1高表達與預后不良相關，而免疫細胞中PD-L1的高表達與預后良好相關。本研究表明，PD-L1在腫瘤細胞中的表達與組織學分級有關，PD-L1在免疫細胞中的表達與腫塊大小和Ki-67有關；PD-L1無論在腫瘤細胞還是免疫細胞中的表達都與DFS和OS無相關性。由于該類乳腺癌預后好，病死率低，本研究的病例相對較少，可能沒能更好地反映PD-L1與預后的關系；但從與一些預后相關的臨床病理參數分析來看，PD-L1陽性表達與一些不良的臨床病理參數相關。

免疫治療開始時，治療效果在很大程度上是由腫瘤內已經存在的TILs介導的，主要是CD8+TILs，具有豐富CD8+TILs的乳腺癌可能對PD-L1免疫抑制劑有更好的療效。有關PD-L1和CD8+TILs的相關性研究多集中于乳腺癌間質，而有關腫瘤細胞內兩者相關性的研究少報道。在一項對早期乳腺癌的研究中發現，CD8+TILs的表達與PD-L1表達呈負相關［22］。一項對180例乳腺癌患者組織微陣列的研究中發現，CD8+iTILs表達與免疫細胞PD-L1表達具有相關性，而CD8+iTILs表達與腫瘤細胞PD-L1表達無相關性［21］。本研究顯示，CD8+iTILs表達與TC中PD-L1表達呈正相關（rs=0.301，P=0.019）。浸潤的CD8+細胞毒性T細胞分泌的干擾素（IFN）-γ是誘導PD-L1表達所必需的［21］，腫瘤細胞PD-L1的表達可能是適應性機制的結果［19］。因此，針對PD-L1的免疫治療，CD8+iTILs高表達患者可能具有較好的療效。然而抗PD-L1單藥治療的有效率只有5%～20%［18］，既然免疫檢查點抑制劑的應用是以腫瘤淋巴細胞浸潤為前提，在非LPBC中TILs數量較少，這可能是抗PD-L1治療有效率低的原因之一。我們在對LPBC的研究中發現，間質PD-L1和CD8+TILs的表達無相關性，這可能會降低該類患者PD-L1免疫治療的療效；隨著對LPBC中腫瘤和間質PD-L1和CD8+TILs的表達進行更深入的研究，可能有助于提高免疫治療的有效率。

綜上所述，間質和瘤內CD8+TILs對LPBC顯示不同的預后預測作用，CD8+iTILs表達與TC中PD-L1表達呈正相關，這可能是CD8+iTILs高表達患者預后差的原因之一，CD8+iTILs高表達的患者可能對PD-L1免疫抑制劑顯示更好的療效。PD-L1與一些與預后相關的臨床病理參數相關，但與DFS和OS無顯著相關性。LPBC患者PD-L1陽性率較高，且預后較好；隨著對LPBC中PD-L1和CD8+TILs表達研究的深入，必將為乳腺癌的免疫治療提供重要的理論基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突