氣相色譜-串聯質譜法測定生物樣品中3種殺鼠劑

2022-12-16 08:20:06劉云富游慧圓吳燕梅

國際醫藥衛生導報 2022年23期

劉云富游慧圓吳燕梅

1惠州市職業病防治院理化室，惠州 516008；2惠州市農產品質量安全監督檢測中心，惠州 516008

毒鼠強，又名四亞甲基二砜四胺，分子式：C4H8N4O4S2，分子量240.27。毒鼠強是20世紀中期研發的急性殺鼠藥，是一種中樞神經興奮劑，具有強烈的致驚厥作用，對各類動物，包括人類毒性都極高，由于其化學性質非常穩定，在生物體內也不易降解，故容易造成長期的鏈條性的污染，造成嚴重的危害［1］。中國已明令禁止生產、使用。氟乙酰胺：俗名敵蚜胺，分子式：C2H4FNO，分子量77.06。氟乙酰胺屬高毒鼠藥，進入人體后脫胺形成氟乙酸，干擾正常的三羧酸循環，導致三磷酸腺苷合成障礙及氟檸檬酸直接刺激中樞神經系統，引起神經及精神癥狀。由于其具有高毒性及穩定性，在20世紀90年代國家已明令禁止使用該種鼠藥。雖然國家已經明令禁止生產使用毒鼠強、氟乙酰胺，然而因為滅鼠效果好，成本低廉，生產工藝簡單，故仍然存在濫用情況［2-3］。在醫院的急診搶救實踐中，仍會遇到因誤食、服毒自殺或投毒所致的病人。溴敵隆，又名樂萬通、溴敵鼠，分子式：C30H23BrO4，分子量527.41。溴敵隆在質譜中會碎裂成另一種物質（為3種同分異構體之一），分子式：C14H11Br，分子量259.14。以溴敵隆為代表的第二代長效抗凝血滅鼠藥為我國市面上流行的主流滅鼠藥。長效抗凝血滅鼠藥主要通過人體消化道攝入引起中毒，主要毒理作用是抑制維生素K依賴性凝血因子的合成，導致凝血障礙［4］。可引起皮膚和臟器出血，中毒后以全身各器官組織的出血為主要表現，例如血尿、鼻衄、顱內出血等，同時伴有凝血指標的異常。由于管理疏漏或使用不當，臨床上常見因誤食、自殺、投毒等原因導致的該類鼠藥中毒患者［5-9］。當前，文獻報道對于毒鼠強和氟乙酰胺的同時測定大多采用氣相色譜-質譜聯用法，對于毒鼠強和溴敵隆的同時測定，采用氣相色譜-質譜聯用法和高效液相色譜-質譜聯用法，尚未見對于3種殺鼠劑同時測定的報道［10-19］。本實驗利用氣相色譜-串聯質譜法（GC-MS/MS）同時測定上述種殺鼠劑，方法的檢出限低，結果準確可靠，可用于急性化學中毒中，可疑鼠藥中毒生物樣品中上述3種殺鼠劑的定性定量測定。

材料與方法

2022年5月至6月于惠州市農產品質量安全監督檢測中心實驗室開展實驗。

1、儀器與試劑

1.1、儀器氣相色譜-串聯質譜儀（三重串聯四級桿氣相色譜質譜儀，廠家：島津，型號：GCMS-TQ8040）；VF-1701ms毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；KQ7200DV超聲波清洗器（江蘇金怡儀器科技有限公司）；Organomation氮氣濃縮儀（N-EVAP?111）；SL-0246漩渦振蕩器（美國Scientific Industries公司）；H1650高速臺式離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；帶10μl微量注射器的自動進樣器。

1.2、試劑毒鼠強標準品（北京中衛永晟科技有限公司，濃度：200μg/ml）、氟乙酰胺標準品（農業部環境保護科研監測所，濃度：100μg/ml）、溴敵隆標準品（農業部環境保護科研監測所，濃度：100 μg/ml）；氯化鈉、無水硫酸鈉：分析純；乙酸乙酯：色譜純。

2、色譜條件

柱溫：初溫40.0℃，保持5.0 min，然后以10.0℃/min升到125.0℃，再以20.0℃/min升到270.0℃，保持3.0 min。進樣口溫度程序：280.0℃，保持時間：10.0 min；以高壓進樣模式進樣，進樣壓力：250.0 kpa，高壓進樣時間：1.0 min；載氣為氦氣，柱流量：1.00 ml/min；不分流進樣，進樣量：2μl。

3、質譜條件

離子源溫度：230℃；接口溫度：300℃；EI電壓：+0.60 eV；溶劑延遲時間：4.0 min；掃描范圍：10～550 amu；SIM離子掃描，毒鼠強：212（定量離子），240，132；氟乙酰胺：44（定量離子），77，60；溴敵隆：258（定量離子），260，178。

4、樣品前處理方法

4.1、血樣移取2 ml血樣于10 ml離心管中，漩渦振蕩（2 000 r/min）1 min，離心（14 000 r/min）5 min，離心半徑15 mm，血漿/血清全部轉移至離心管中，加入2 ml乙酸乙酯和1 g氯化鈉，將離心管置于超聲儀內進行超聲萃取5 min，再離心（14 000 r/min）5 min，取出全部上清液于5 ml具塞刻度錐形玻璃管中，置于40℃氮吹儀中濃縮吹至0.2 ml（或者吹干，然后再加200μl復溶，振搖1 min，靜置。若含有水分導致吹不干，需用無水硫酸鈉脫水），進樣2μl（如果濃縮液渾濁，則要過濾后進樣）。

4.2、尿樣振搖尿樣，靜置，取2 ml尿樣+1 ml乙酸乙酯+1 ml丙酮+1 g氯化鈉于10 ml離心管中，以下前處理步驟同血樣處理。

5、混合標準儲備溶液的配制

取2 ml容量瓶，先加入少量乙酸乙酯，然后分別加入500 μl毒鼠強標準溶液、200 μl氟乙酰胺標準溶液，500 μl溴敵隆標準溶液，用乙酸乙酯定容至刻度，得到乙酸乙酯中毒鼠強、氟乙酰胺和溴敵隆濃度分別為50μg/ml、10μg/ml、25μg/ml的3種滅鼠劑混合標準貯備液。

結果

1、總離子流色譜圖及質譜圖

在選定的分析條件下，采用全離子掃描（SCAN）模式對加入乙酸乙酯、血樣和尿樣中的3種滅鼠劑進行測定，用NIST庫對色譜峰進行譜庫檢索，其總離子流色譜圖及質譜圖見圖1～圖6。總離子流色譜圖中，氟乙酰胺的色譜峰保留時間為6.216 min，毒鼠強的色譜峰保留時間為20.759 min，溴敵隆色譜峰的保留時間為20.934 min。根據全掃描質譜圖選取豐度相對較高的特征離子碎片進行SIM模式檢測，選取的離子為：毒鼠強：42，212（定量離子），240；氟乙酰胺：44（定量離子），60，77；溴敵隆：178，258（定量離子），260。

圖1 3種滅鼠劑的總離子流色譜圖(標準溶液)

圖6 溴敵隆的質譜圖

2、標準工作曲線與檢出限、定量下限

于2 ml血樣和尿樣中各加入毒鼠強、氟乙酰胺、溴敵隆標準貯備液各16μl、32μl、64μl、128μl、320μl。按樣品前處理方法處理后進樣測定，以各目標物的定量離子色譜峰峰面積y對其質量濃度x（μg/ml）進行線性回歸處理，3種殺鼠劑的檢出限和定量下限計算結果見表1。按照職業人群生物監測方法推薦的檢出限和定量下限測定方法［20］。以低濃度樣品，按實驗方法進行分析，以樣品信號的3（10）倍標準差（n=7），與低劑量的待測物濃度及其響應值計算所得的待測物濃度，所得濃度即為方法檢出限（MDL）、定量下限（MQL），計算公式：

表1 3種滅鼠劑工作曲線、檢出限和定量下限

K：樣品預處理體積轉換倍數；S：測定響應信號的標準差；c：配制的3種殺鼠劑的低劑量濃度；b：c對應的響應信號。

3、方法回收率實驗與方法精密度實驗

取空白血樣和尿樣，配制血中毒鼠強濃度分別為0.6μg/ml、1.0μg/ml、4.0μg/ml的混合標準溶液，尿中毒鼠強濃度分別為0.3 μg/ml、0.5 μg/ml、1.5 μg/ml的混合標準溶液，血中氟乙酰胺濃度分別為0.07μg/ml、0.17μg/ml、0.4μg/ml的混合標準溶液，尿中氟乙酰胺濃度分別為0.3 μg/ml、0.5 μg/ml、1.5 μg/ml的混合標準溶液，血和尿中溴敵隆濃度分別為0.3 μg/ml、0.7 μg/ml、3.0 μg/ml的混合標準溶液，同樣品處理后，各進行6次平行測定，最后計算每種殺鼠劑的平均回收率和相對，結果見表2。