兩種灰區標本處理方法對丙肝抗體檢測干擾的消除效果評價

葉紅玲 李娜 曾健 侯思南

1南京醫科大學康達學院附屬連云港第二人民醫院連云港市第二人民醫院檢驗科，連云港 222002；2連云港市中醫院檢驗科，連云港 222004

丙型肝炎病毒（HCV）在我國某些地區呈低流行狀態，蔣均等［1］建議加強對1957—1986年出生人群和血液透析科、感染科及肝病科就診者HCV感染的血清學篩查。化學發光免疫分析法（CLIA）通過檢測抗HCV抗體（Anti-HCV）成功地應用于HCV感染者的篩查，具有動態范圍寬、高特異性、高靈敏度、周轉時間短等優點［2-3］。Anti-HCV的檢測通常是定性的，要么是陽性，要么是陰性。運用雅培i2000化學發光分析儀檢測HCV抗體雖可檢出陽性患者，但存在假陽性結果，臨床應謹慎應用［4-5］。一些研究發現，吸光度和臨界值比值（S/CO）的樣品通常出現假陽性結果。在血液透析患者等免疫功能低下的人群中，出現抗-HCV抗體假陽性的結果在15%左右［6］。Dufour等［7］對S/CO的樣本做了重組免疫印跡分析（recombinant immunoblot assay，RIBA）檢測，發現86%的樣本為HCV陰性，故建議對低陽性值的樣本進行RIBA補充試驗以避免報告假陽性結果［8］。Heinrichs等［9］研究發現，HCV血清學檢查在有左心輔助設備（LVAD）的患者中存在假陽性，建議此類患者的CLIA反應陽性應通過HCV免疫印跡和HCV RNA檢測確認，以排除HCV感染。陸銀華等［10］建議對i2000SR檢測Anti-HCV灰區（S/CO值為1.00～9.41）樣本，應至少使用2種檢測系統或使用高特異性的檢測系統進行復檢。對于低陽性值樣本，實驗室應充分考慮不同檢測系統之間可能出現的結果不一致現象，制定合理灰區范圍和確定最佳臨界值［11-15］。

內源性干擾在臨床免疫檢測中較為常見。檢驗人員應采取措施，識別和排除內源性干擾物，保證檢驗結果的可靠性［16］。動物血清或動物源性免疫球蛋白通常用來封閉嗜異性抗體（HA），當其與待測樣本共同孵育后，能結合樣本中的HA或人抗動物抗體（HAAA），通過空間位阻阻遏HA/HAAA與檢測或捕獲抗體結合，從而封閉HA/HAAA的 干 擾 作 用［17］。Batteiger等［18］使 用 含 非 離 子 洗 滌 劑Tween20的PBS作為阻斷劑，能有效阻斷硝酸纖維素膜（NCM）上未被占據的蛋白結合位點，獲得的條帶背景明顯低于使用大量牛血清白蛋白（BSA）或載體血清作為阻斷劑。為了消除內源性干擾物對抗-HCV抗體的干擾，我們分別采用小鼠血清（MS）和磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate tween buffer，PBST）封閉患者標本可能存在的非特異性抗體，處理后以CLIA法復檢，并評價干擾消除效果，現報道如下。

材料與方法

1、研究材料

1.1、研究對象研究病例是連云港市中醫院檢驗科2017年2月至2019年11月間-20℃保存的雅培i2000SR化學發光儀檢測的丙肝抗體結果即標本S/CO>1的血清樣本151例、S/CO<1的血清樣本40例（通過LIS系統查詢初篩檢驗報告）。當S/CO比值>1.0時初篩試驗判斷為陽性反應。連云港市中醫院倫理委員會根據《赫爾辛基原則宣言》審查通過了此研究方案。

1.2、設備與試劑雅培i2000SR全自動化學發光儀（廠家：美國雅培公司，配套丙肝抗體試劑，批號：03231BE00、03586BE00、03531BE00、04539BE00、94016LI00等）；小鼠血清封閉液（廠家：北京鼎國昌盛生物技術公司，生產批號：80M00150）；Tween20（廠家：歐蒙醫學診斷中國有限公司，批號：F190403CA）；PBS（廠家：歐蒙醫學診斷中國有限公司，批號：F191010CB）；丙肝抗體質控品（廠家：北京康徹斯坦公司，濃度：2 NCU/ml，批號：201811002）。丙肝抗體確證（RIBA）和HCV-RNA外送金域醫學檢驗中心檢驗。

2、研究方法

本研究為病例對照研究。對所有受試標本以RIBA法檢測，對結果為不確定的標本加做HCV RNA。以確證試驗結果為標準，采用Kappa檢驗比較處理前后一致性，并繪制丙肝抗體受試者工作特征曲線（ROC），從而明確Anti-HCV的最佳診斷界值和灰區范圍。灰區的標本用正常小鼠血清、PBST分別封閉處理后，以雅培i2000SR復檢丙肝抗體。所有操作嚴格按實驗室標準操作程序進行。

按廠家說明書配置0.1%（W/V）PBST。小鼠血清在使用前需經56℃水浴30 min滅活補體。處理步驟如下：（1）在2個EP管內各加入患者血清200 μl，其中1管加入小鼠血清200 μl，另1管加入0.1%（W/V）PBST 200 μl，充分混勻。（2）將小鼠血清管置于37℃水浴30 min，PBST管、小鼠血清管靜置于室溫1 h。（3）小鼠血清管以2 000 g/min瞬間離心，PBST管以3 500 g/min離心10 min。（4）兩管均在雅培i2000SR上復測Anti-HCV，檢驗結果乘以稀釋倍數2。

3、統計學處理

本研究的計量資料符合正態分布，使用SPSS 24.0軟件對實驗數據采用Kappa檢驗統計分析。P<0.05為差異有統計學意義。若Kappa<0.4，則表示一致性較差；若0.75>Kappa≥0.4，則表示一致性一般，若Kappa≥0.75，則表示一致性較好。以確認結果為標準，繪制標本處理前后丙型肝炎病毒抗體的ROC。

結 果

1、以雅培i2000SR檢測Anti-HCV的最佳診斷界值的確立

見表1和圖1。雅培i2000SR檢測Anti-HCV項目時，不同的S/CO比值靈敏度、特異度、約登指數（靈敏度+特異度-1）分別如表1所示。因為約登指數越接近于1診斷效能最佳，從而可以看出當Anti-HCV的S/CO比值為5.02時，約登指數為最高值（0.919），所對應的靈敏度為97.4%，特異度為94.5%，將其確定為最佳S/CO比值。Anti-HCV的S/CO比值在0.89時，靈敏度為100.0%；Anti-HCV的S/CO比值5.97時，特異度為100.0%，因此Anti-HCV的灰區范圍設置為0.89～5.97。

表1 雅培i2000SR檢測Anti-HCV的不同臨界值條件下的診斷效能

2、兩種方法處理前后Anti-HCV與確認試驗結果的一致性及診斷效能變化

RIBA檢驗結果為陰性75例，陽性109例，不確定7例，經加做HCV RNA補充試驗最終確認陰性為76例，陽性為115例。通過整理對比被測者復檢和確認試驗結果，觀察灰區標本在處理前后與確認試驗結果的差異性，如表2所示。灰區標本未做處理、小鼠血清和PBST處理后，Anti-HCV與確證試驗結果的一致性Kappa值分別為0.551、0.900、0.854；以i2000SR檢測Anti-HCV的靈敏度分別為98.3%、100.0%、99.1%，特異度分別為52.6%、88.1%、84.2%，陽性預測值分別為75.8%、92.7%、90.5%，陰性預測值分別為95.2%、100.0%、98.5%。

表2 兩種方法處理前后Anti-HCV與確認試驗結果的一致性及診斷效能變化

3、以確認試驗結果為標準繪制的標本在處理前后檢測Anti-HCV項目的ROC

雅培i2000SR檢測Anti-HCV的曲線下面積（AUC）分別為0.980、0.996和0.987。灰區標本處理前、小鼠血清和PBST封閉后，i2000SR檢 測Anti-HCV ROC分析 的AUC分別為0.980、0.996、0.987，以小鼠血清封閉法AUC最大（圖1和表3）。

表3 基于151例灰區標本處理前后Anti-HCV檢測數據繪制ROC曲線下面積

圖1 以確認試驗結果為標準繪制的標本處理前后Anti-HCV的ROC

討 論

裘宇容等［19］研究發現，與臨床不符的丙型肝炎抗體陽性（電化學發光法及ELISA法）標本應用綿羊血清封閉人血清中的HA以排除干擾，檢測封閉后標本的Anti-HCV，結果為陰性。雅培i2000SR運用CLIA法定性測定人血清中的Anti-HCV。整個檢測過程首先將待檢血清、項目稀釋液、HCV抗原包被的順磁微粒子混合。待檢血清Anti-HCV和HCV抗原包被的微粒子充分結合。經過沖洗后，加入吖啶酯標記的鼠抗人熒光抗體，再次沖洗，將預激發液和激發液加入到反應液中，通過測定發光值判斷待測血清中的HCV抗體含量。由于結合物中的熒光標記的抗體是鼠抗人抗體，而我們研究所選擇的是正常小鼠血清封閉待測血清，所以有可能存在非特異性抗體后要再次復檢。

Arya等［20］報道了一種用于檢測和估計乳腺癌的生物標志物-人表皮生長因子受體2（HER2）的電容式傳感器研制。該研究包括用于制備電化學平臺的插入叉指金電極，采用與HER2親和的巰基末端DNA適體制備生物識別層通過在叉指金表面上的自組裝，用0.05%吐溫20（PBST-20）阻斷劑阻止表面的可用空間，從而阻止了非特異結合。在復檢灰區標本的ARCHITECT i2000SR Anti-HCV時，本研究用終濃度為0.05%的Tween20（PBST-20），阻斷重組HCV抗原表面未被Anti-HCV占據的可用空間，封閉了標本中干擾物的非特異性結合，從而提高了雅培i2000SR檢測Anti-HCV的準確性。

此次研究結果表明，雅培i2000SR檢測灰區標本時標本處理前和在小鼠血清和PBST封閉后對比，Anti-HCV與確認試驗結果的一致性均明顯增高，以小鼠血清封閉最為明顯；ARCHITECT i2000SR檢測Anti-HCV的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值還有AUC都提高顯著，其中正常小鼠血清封閉檢驗效能最為顯著。證實用正常小鼠血清消除免疫干擾的效果最理想。

在實踐中很難確定消除患者樣本中所有干擾的阻斷劑的準確用量，因為對于干擾的免疫反應性抗體在個體之間變化很大，所加入的阻斷劑的有效性取決于其種類和亞類［21］。此次研究結果雖然表明利用小鼠血清封閉或PBST處理后檢驗效能會有很大提高，但是還是有少數假陽性標本在處理之后還會出現假陽性現象，而此樣標本仍然需要進行HCV確認試驗。RIBA檢測的是丙型肝炎病毒感染者血液中的抗HCV抗體，主要用于一線篩查時丙型肝炎病毒檢測顯示陽性或不確定結果的二次確認試驗［22］。

Chiu等［21］認為，當懷疑實驗室數據和臨床不一致時，實驗室檢測干擾可能需要使用另一種方法。Huang等［23］分別使用Elecsys電化學發光（ECL）和雅培化學發光微粒免疫分析（CMIA），采用雙檢法測定抗-HCV的策略，以減少抗-HCV檢測中的假陽性；或使用附加阻斷劑，或用非免疫血清中和稀釋樣本。實驗室應意識到所有免疫分析的潛在干擾，以及人工結果如何可能導致誤解、隨后的錯誤診斷和不合理的治療。這些干擾雖然是相對不常見的，但是臨床醫生需要意識到它們有存在的可能性，并警惕臨床和生物數據的不匹配。王菊英等［24］研究發現，由于HCV RNA存在間歇性復制特點，可能會導致RIBA檢測陽性而RNA檢測陰性的情況發生；而要明確丙肝是否為現癥感染，則需要檢測HCV抗體陽性者血中HCV RNA載量［25］，因此對這種異常測試結果的識別需要實驗室和臨床醫生的持續監控。加強臨床醫生與臨床實驗室就意外事件的溝通，可避免基于異常的免疫檢測結果的不適當臨床干預。利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突