基于網絡藥理學和分子對接技術探討歸腎丸治療圍絕經期綜合征的有效成分及作用機制

余惠，張永青，季曉黎

（成都中醫藥大學，四川 成都 610000）

0 引言

圍絕經期綜合征（menopausal syndrome，MPS）是指女性絕經前后由于卵巢始基卵泡儲備逐漸耗竭導致激素波動而出現的一系列軀體、精神、心理癥狀[4]。在此階段的女性，隨著卵巢功能逐漸衰退，雌激素水平開始下降，可面臨一系列癥狀，如潮熱盜汗，月經紊亂，頭暈心悸等。治療上西醫主要采用激素，但長期服用激素會使心血管疾病、腦血管意外、子宮內膜病變、卵巢癌等發病率增加。中藥在調節女性內分泌方面具有獨特優勢，不良反應少，作用持久，且易于接受[5]。歸腎丸是治療MPS療效明確的經典方，方中重用熟地滋補腎陰；山萸肉滋補肝腎，山藥滋腎補脾，助君藥滋陰之力，菟絲子滋補腎精，杜仲溫補腎陽，共為輔藥；枸杞養陰益精，當歸補血調經，茯苓滲濕健脾，合為佐使藥。全方以滋陰為主，兼補腎陽，共奏滋陰補腎之功[6]。本研究擬用網絡藥理學技術，通過構建“藥物成分-作用靶標-疾病靶標”網絡，從分子層次闡釋歸腎丸治療MPS作用原理，挖掘出歸腎丸治療MPS的潛在作用機制。

1 資料與方法

1.1 歸腎丸有效活性成分及相應靶標的篩選

登錄TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），將歸腎丸中的藥物依次輸入進行檢索，設置OB＞30%、DL＞0.18，獲得藥物有效活性成分并收集對應的靶標。應用蛋白質數據庫（UniProt），將獲得的靶標進行通用名稱注釋。

1.2 圍絕經期綜合征靶標的收集

登錄Gene Cards數據庫（https：//www.genecards.org/）、OMIM數據庫（https：//omim.org/），依次輸入關鍵詞“Perimenopausal syndrome”，“Climacteric syndrome”，“MPS”，檢索獲得圍絕經期綜合征的相關靶標，將檢索獲得的所有疾病靶標進行匯總。

1.3 歸腎丸活性成分靶標與圍絕經期綜合征共同作用靶標的獲取

運用Venny2.1軟件繪制歸腎丸活性成分靶標與MPS相關靶標關系的韋恩圖。圖中交集的部分為兩者的共同作用靶標，通過韋恩圖可得到共同作用靶標的數目，得到的共同作用靶標數目越多，表明兩者之間的關系越緊密。

1.4 靶點蛋白相互作用圖（PPI）網絡的構建

將通過韋恩圖取交集得到的共同作用靶標上傳至STRING數據庫，得到靶標蛋白互作網絡圖，保存其為TSV格式圖片[7]。通過靶點蛋白相互作用圖可得到歸腎丸治療MPS的核心靶標。

1.5 中藥-成分-靶點網絡構建

將PPI 網絡圖導入 Cytoscape3.7.2軟件，構建“中藥-成分-靶點網絡”圖，藥物活性成分和作用靶點以“節點”表示，節點之間的相互作用以“邊”表示[8]。計算網絡拓撲參數，以靶點在網絡中的度（degree）值的大小來篩選歸腎丸治療MPS的關鍵靶點，度值排前的關鍵靶點即為歸腎丸治療MPS的關鍵靶點。由此篩選出的關鍵靶點可作為接下來分子對接的對象。

1.6 GO和KEGG富集分析

借 助R語 言 利 用Bioconductor軟 件（http：//www.bioconductor.org/install/），將兩者的共同作用的靶點進行GO和KEGG通路富集分析，并將得到的分析結果進行可視化。

1.7 分子對接

將1.5中得到的關鍵靶點輸入PDB數據庫（http：//www.rcsb.org/），下載3D蛋白質結構，導入PyMol 2.3.4軟件（https://pymol.org/2/）對關鍵蛋白進行處理后，保存后導入 Autodock 4.2.6 軟件（http://autodock.scripps.edu）再次進行處理。在 TCMSP 數據庫中下載對接成分，保存為“mol2”結構，利用 Autodock 進行核心成分的分子對接。

2 結果

2.1 歸腎丸有效活性成分及相應靶標的篩選

從TCMSP數據庫中獲得歸腎丸總化合物896個，設置OB＞30%及DL＞0.18后得到有效化學成分139個，去除重復項后共獲得有效活性成分120個，選取前10個有效活性成分（見表1）。

表1 歸腎丸中列舉的前10個有效活性成分

2.2 圍絕經期綜合征靶標的收集

登錄GeneCards、OMIM數據庫輸入關鍵詞“Perimenopausal syndrome”，“Climacteric syndrome”，“MPS”，篩選出圍絕經期綜合征3049個相關靶點。

2.3 歸腎丸活性成分靶標與圍絕經期綜合征共同作用靶標的獲取

應用Venny2.1軟件，將歸腎丸120個有效活性成分靶標與圍絕經期綜合征3049個相關靶標輸入后得到韋恩圖（見圖1），得到兩者共同作用靶標129個。

圖1 歸腎丸有效活性成分靶標與圍絕經期綜合征相關靶標的韋恩圖

2.4 PPI網絡圖的構建及分析

登錄STRING數據庫，將通過韋恩圖取交 集得到的共同作用靶標匯總表上傳，由此可得到靶標蛋白互作網絡圖，（如圖2）。

圖2 共同作用靶標蛋白互作網絡

2.5 中藥-成分-靶點網絡構建及分析

將PPI 網絡圖導入 Cytoscape3.7.2軟件，構建“中藥-成分-靶點網絡”圖（見圖3），將鏈接靶標數量進行降序排列，可得到歸腎丸治療圍絕經期綜合征的前5位有效活性成分，依次為槲皮素、豆甾醇、山奈酚、表兒茶素、β-谷甾醇；將鏈接活性成分數量進行降序排列，可得到歸腎丸治療圍絕經期綜合征的前3位主要靶標，依次為RELA、PGR、SLC6A3。利用R語言軟件獲取核心靶標，選取排名靠前的靶標，包括AKT1、ALB、IL6、VEGFA、CASP3等（見圖4）。

圖3 歸腎丸治療圍絕經期綜合征活性成分-共同靶標互作網絡

圖4 鄰接節點數排名前30位的核心靶標

2.6 GO及KEGG分析

通過Bioconductor軟件對共同靶點進行GO及KEGG分析，設置P＜0.05，借助R語言軟件完成。可得到146個GO分析結果（見圖5）。從圖中可見歸腎丸治療MPS的生物過程主要是參與DNA結合轉錄因子結合、RNA聚合酶II特異性DNA結合轉錄因子結合、細胞因子受體結合等方面。KEGG分析結果得到159個（見圖6）。從圖中可見歸腎丸治療MPS的關鍵信號通路有糖尿病并發癥中的AGE-RAGE、TNF、HIF-1信號通路。

圖5 歸腎丸對MPS作用的前20位GO功能分析結果

圖6 歸腎丸對MPS作用的前20位KEGG通路分

2.7 分子對接

為討論網絡藥理學預測的準確性，我們在網絡圖中選取degree較高的前5個成分（槲皮素、豆甾醇、山奈酚、表兒茶素、β-谷甾醇）和degree較高的4個靶點（JUN、RELA、MAPK1、IL6）在Autodock 4.2.6 軟件中進行分子對接。成分與靶點結合能形成的氫鍵數目或構成π-π結合是決定結合能力的重要指標之一，而結合能越低則表明親和力越強，氫鍵數目越多則結合越穩定[9]。如表2所示，成分與靶點均具有一定的親和力，其中表兒茶素與RELA、JUN結合具有良好穩定性，槲皮素與JUN有良好的穩定性，其余大多數藥效成分能與對接靶點構成氫鍵增強穩定性，其中槲皮素、山奈酚、表兒茶素可與RELA形成π-π結合，這有助于增強結構穩定性。對上述對接結果利用 PyMol 2.3.4 軟件繪圖（圖7），以上分子對接結果表明，表兒茶素、山奈酚、槲皮素等成分可能是歸腎丸治療圍絕經期綜合征的潛在有效活性成分，可能通過JUN、RELA、MAPK1、IL6這些靶點發揮作用。

表2 核心成分與靶點的結合情況

圖7 蛋白對接構象

3 討論

古代醫籍對圍絕經期綜合征無專篇記載，多散見于“年老血崩”“臟躁”“百合病”等病證中[10]。如《金匱要略》中指出：“婦人年五十所，暮即發熱，手掌煩熱，唇口干燥[11]。”處于圍絕經期階段的婦女，天癸逐漸枯竭，沖任逐漸虛衰，肝腎虛損，氣血失調，臟腑功能、腎之陰陽趨于失衡狀態[12]。因此本病的治療關鍵在于調補腎之陰陽，使其腎中陰陽平衡，氣血和調，沖任不虛，則圍絕經期癥狀可得到有效緩解。歸腎丸是《景岳全書》中的經典方，能夠調整臟腑功能，使人體內氣機平和，陰陽達到平衡。在現代臨床運用中，我們只要準確把握疾病陰陽失調之病機，便可靈活運用此方進行加減治療各種陰陽失衡所導致的疾病。因此，我們推斷歸腎丸能夠明顯改善圍絕經期婦女的臨床癥狀，且在多項臨床研究中能夠得到證實，但對其具體治療作用機制知之甚少，因此，本研究擬用網絡藥理學技術，從分子層次闡釋歸腎丸治療MPS作用原理，分析其治療MPS的具體作用機制。

TCMSP數據庫篩選及關鍵節點推斷出槲皮素、山柰酚、豆甾醇、谷甾醇等可能為治療圍絕經期綜合征的關鍵活性成分。槲皮素、山萘酚具有很好的抗炎、抗氧化應激等卵巢保護作用，能夠促進卵巢卵泡發育和成熟。豆甾醇、谷甾醇對去卵巢小鼠內源激素不平衡狀況可以明顯改善，而β-谷甾醇可明顯促進卵巢顆粒細胞分泌雌激素E2[13]。PPI網絡拓撲分析顯示,ALB、IL6、VEGFA等可能是歸腎丸治療圍絕經期綜合征的核心靶標。女性排卵一直被認為是一個復雜的炎癥反應過程，而數據表明ALB的治療機制是通過對炎癥和氧化應激的調節發揮作用[14]。IL-6 在體內外均可以調節胎鼠生殖細胞的存活、增殖和分化。EGFR能促進卵母細胞的成熟及卵巢顆粒細胞的增殖分化，還能調節激素的分泌從而影響垂體功能并在卵泡發育過程中發揮重要作用。

KEGG分析顯示，歸腎丸治療圍絕經期綜合征的主要信號通路是糖尿病并發癥中的 AGERAGE、TNF及HIF-1信號通路。研究表明，抑制AGE-RAGE信號通路，可以降低氧化應激與炎癥反應，維持內環境穩態[15]。而TNF信號通路是核心炎癥信號通路，可通過發揮炎癥作用從而影響卵巢顆粒細胞來調節卵泡成熟和排卵。此外，HIF-1信號通路可促進卵巢發揮其生理功能，防止卵巢過早衰竭。由此可見，歸腎丸中的山柰酚、豆甾醇、槲皮素等有效活性成分可能是通過介導以上關鍵信號通路發揮促進卵泡發育、調節激素水平、抗炎等藥理作用來改善女性圍絕經期癥狀。

綜上所述，歸腎丸可能通過山柰酚、豆甾醇、槲皮素等有效活性成分，作用于JUN、RELA、MAPK1、IL6等關鍵靶點，其中主要涉及糖尿病并發癥中的AGE-RAGE、TNF及HIF-1等關鍵信號通路來實現治療圍絕經期綜合征的目的。因此，本研究表明，歸腎丸治療圍絕經期綜合征呈現出多成分、多靶點、多通路的作用優勢，可為后續中醫藥治療圍絕經期綜合征的科學研究和臨床應用提供參考依據。