松脂醇二葡萄糖苷對青年大鼠骨代謝的影響

謝高倩，高玉海，魏 朋，何玥穎，柏 鑫 ，陳 卓，秦 昆，郭建魁，陳克明，牛廷獻

(1. 聯勤保障部隊第九四〇醫院基礎醫學實驗室，2. 甘肅省干細胞與基因藥物重點實驗室，3. 聯勤保障部隊第九四〇醫院科訓科，甘肅 蘭州 730050)

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種隨年齡增長而發病率逐漸增加的疾病，人口老齡化現象將導致世界人口中OP和脆性骨折的比例逐年增加[1]。骨形成和骨吸收之間的平衡對于保持骨骼健康至關重要[2]，骨吸收量高于骨形成量的骨代謝失衡是導致OP的重要原因之一，因此，抑制骨吸收是預防和治療OP的重要手段。例如雙膦酸鹽是目前公認療效較為理想的抗骨吸收一線藥物[3]，但其缺點是對消化道有刺激損傷作用，而且長期使用存在導致下頜骨壞死的風險[4]。近年來的研究表明，提高峰值骨量(peak bone mass，PBM)可以降低晚年發生OP及脆性骨折的風險，通過增加峰值骨量來預防OP是一種有效且可靠的策略[5]。所謂PBM是指人或脊椎動物一生所能達到的最高骨量，主要由遺傳因素決定，但也可能受到營養和生活方式等因素的影響[6]。本課題組最先報道淫羊藿苷可提高大鼠峰值骨量，是淫羊藿苷可能用作抗骨質疏松藥物的重要機制之一[7]。杜仲又稱“思仲”、“木棉”、“思仙”，味甘，性溫，歸肝、腎經，具有補肝腎、強筋骨、安胎之效，是我國傳統中草藥[8]。已有研究表明，杜仲提取物能有效改善實驗大鼠的骨代謝，起到抗骨質疏松的作用[9-11]，但發揮作用的有效成分至今尚無定論。松脂醇二葡萄糖苷(pinoresinol diglucoside，PDG)是杜仲皮中的一種木脂素類物質，也是杜仲藥材的質量控制指標。吳思敏等[12]曾報道，PDG能體外促進大鼠顱骨成骨細胞的增殖與分化，但有關PDG的抗骨質疏松體內實驗鮮有報道。

本文報道PDG對青年大鼠骨代謝的影響，以提供PDG是否為杜仲主要抗骨質疏松有效成分的實驗依據，為開發源自杜仲的抗骨質疏松新藥奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 選取體質量在100 g左右的1月齡SPF級SD雌性大鼠30只，許可證編號：SYXK(軍)2017-0047，倫理審核編號：2021KYLL112，飼養于聯勤保障部隊第九四〇醫院SPF級動物實驗中心。飼養溫度為(25±2)℃，濕度60%～70%，自由攝水與進食，所有實驗操作均嚴格按照“3R”原則進行，盡可能減少對實驗動物的傷害。

1.1.2主要試劑與儀器 PDG購于成都儀睿生物科技有限公司(產品批號：YRS003-210301)；4%多聚甲醛中性組織固定液購于武漢塞維爾生物科技有限公司；四環素購于日本TCI公司，鈣黃綠素購于德國Sigma公司；OPG、RANKL定量檢測試劑盒購于泉州睿信生物科技有限公司；一抗：Runx-2和RANKL購于英國Abcam公司，OPG購于美國Santa Cruz公司，BMP-2、Osterix和β-actin購于美國Affinity公司；二抗：Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)購于英國Abcam公司；Micro CT購于平生醫療科技(昆山)有限公司(型號：NMC-100)；雙能X線骨密度儀購于美國GE公司(型號：Prodigy)；熒光顯微鏡購于日本奧林巴斯公司(型號：BX51+DP71)；硬組織切片機購于德國LEICA公司(型號：鋸式Leioa sp1600)；電泳儀和電轉膜儀購于美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1動物分組與給藥 將實驗大鼠采用隨機數字表法分為3組，每組10只，分別為Control組、PDG-25組和PDG-50組。低劑量給藥組(PDG-25)灌胃25 mg·kg-1PDG，高劑量給藥組(PDG-50)灌胃50 mg·kg-1PDG，對照組(Control)灌胃等體積蒸餾水。每周周一到周六上午灌胃，周日不灌胃。持續灌胃6周后，取材并開展各項指標檢測。

1.2.2組織病理學檢測 大鼠處死后，取出心、肝、脾、肺、腎及子宮，剝離周圍的脂肪組織并迅速固定于4%多聚甲醛固定液中。將各器官固定2周后取出，進行包埋、切片與HE染色，在顯微鏡下觀察各器官有無明顯病理學改變。

1.2.3離體骨密度檢測 處死大鼠后剝離得到椎骨和右側股骨，整齊且方向統一的擺放于雙能X線骨密度儀上檢測離體骨密度。

1.2.4Micro CT分析 從每組新鮮剝離的左側股骨中隨機取5根固定在4%的多聚甲醛中。Micro CT掃描條件：電壓70 kV，電流200 μA，分辨率為中度。用Cruiser軟件掃描獲得原始圖像并得到縱截面最大剖面圖，選擇骨骺線下1.5～3.5 mm區域通過Avatar系統重建，得到骨小梁立體圖以及松質骨的骨形態參數。

1.2.5血清骨代謝生化指標檢測 腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠后，采用腹主動脈采血法抽取血樣，4 000 r·min-1離心15 min，取上清，-80 ℃保存。采用ELISA檢測450 nm處的OD值，按照試劑盒說明說繪制標準曲線并計算出大鼠骨保護素OPG和RANKL的含量，結果表示為ng·L-1。

1.2.6雙熒光標記與不脫鈣切片制作 大鼠處死前13、14 d皮下注射四環素，劑量為30 mg·kg-1；處死前3、4 d皮下注射鈣黃綠色，劑量為5 mg·kg-1；處死取材時分離出左側脛骨保存于70%的酒精中，脫水處理后進行不脫鈣塑料包埋。包埋完成后使其固定于切片機上，切片厚度為7～10 μm，經1 500～2 000目的砂紙打磨后，在顯微鏡下觀察雙熒光標記的結果。

1.2.7Western blot檢測 從左側股骨中隨機取5根并剔除周圍肌肉等組織，剪碎后放于組織勻漿儀中研磨，研磨完成后加入高效組織蛋白裂解液，取上清用BCA蛋白濃度測定試劑盒測蛋白濃度，以最低濃度進行稀釋并加入蛋白上樣緩沖液，98 ℃變性15 min待恢復室溫后，-80 ℃保存。取蛋白樣品，配制10%SDS-PAGE分離膠分離蛋白，110 V電轉90 min至PVDF膜上，放于5%脫脂奶粉中封閉2 h，分別置于裝有一抗的自封袋中4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜后，二抗孵育1.5 h，清洗后曝光檢測蛋白信號。

2 結果

2.1 給藥安全性分析自實驗開始的第1周至第6周，給藥組大鼠和對照組大鼠的進食量和飲水量無明顯差別，體質量差異無顯著性(P<0.05)，且均精神狀態良好。各組大鼠主要臟器的組織病理學觀察均未發現明顯病變(Fig 1)。這些結果提示，本實驗所采用的兩種劑量的PDG對青年大鼠無明顯毒副作用。

Fig 1 Histopathological examination results of main organs of rats in each group (HE,scale bar=100 μm)

2.2 離體骨密度檢測灌胃6周后處死所有大鼠檢測離體骨密度。如Fig 2所示，PDG-25組的股骨骨密度和椎骨骨密度均明顯高于Control組(P<0.05)，PDG-50組明顯高于Control組(P<0.01)。PDG-50組雖高于PDG-25組，但兩組間差異無統計學意義。以上結果說明，PDG能明顯提高青年大鼠骨密度。

Fig 2 Results of bone mineral density in different of rats in each *P<0.05，**P<0.01 vs control

2.3 股骨Micro CT成像分析股骨Micro CT分析得到的最大剖面圖顯示，PDG-25組和PDG-50組松質骨骨小梁數量明顯增多(Fig 3)。重建得到的3D效果圖可以看出，PDG-25組和PDG-50組骨小梁更加密集且骨小梁間距更小(Fig 4)。如Fig 5所示，PDG-50組骨體積分數(BS/TV)和骨小梁數(Tb.N)明顯高于Control組(P<0.01)、骨小梁厚度(Tb.Th)明顯高于Control組(P<0.05)，且骨小梁分離度(Tb.Sp)極明顯低于Control組(P<0.01)。結果提示PDG可促進青年大鼠骨形成從而增強骨微結構。

Fig 3 Maximum profile of micro CT imaging analysis of femur in each group

2.4 血清骨代謝生化指標結果如Fig 6所示，PDG-25組血清OPG含量顯著高于Control組(P<0.05)，PDG-50組OPG含量明顯高于Control組(P<0.01)；PDG-50組RANKL含量顯著低于Control組(P<0.01)。說明PDG促進青年大鼠骨形成的同時也能抑制骨吸收作用。

Fig 4 3D reconstruction map of Micro CT imaging analysis of femur in each group

Fig 5 Quantitative analysis of Micro CT indexes of femoral cancellous bone in each *P<0.05，**P<0.01 vs control

Fig 6 Content of OPG and RANKL in serum *P<0.05，**P<0.01 vs control

2.5 脛骨雙熒光標記結果如Fig 7、8所示，黃色為四環素標記，綠色為鈣黃綠素標記，雙熒光間的間距代表10 d內骨的生長。PDG-25組和PDG-50組四環素和鈣黃綠素之間的標記均明顯大于Control組，且PDG-50組的間距大于PDG-25組。說明在相同時間內，給藥組的骨形成作用有明顯提高。

2.6 骨形成與骨吸收相關蛋白表達情況如Fig 9所示，PDG-25組和PDG-50組BMP2、Runx-2、OSX和OPG的蛋白表達量均明顯高于Control組，RANKL的蛋白表達量明顯低于Control組，此結果與血清骨代謝指標檢測結果相一致。提示PDG可能通過上調BMP2、Runx-2、OSX和OPG的表達，下調RANKL的表達，來提高青年大鼠的骨形成。

3 討論

OP常常在第一次骨折發生之前沒有癥狀，被認為是一種無聲的慢性疾病，其特征是骨微結構破壞和骨骼強度降低[12]。在全球范圍內，OP每年導致890萬起骨折，平均每3 s就會發生一次骨質疏松性骨折。骨質疏松癥及其相關并發癥也是老年人發病和死亡的常見原因[13]。因此，向所有健康的青少年、成年人提供預防OP的措施迫在眉睫。PBM被定義為生命中最高的骨密度值[14]。有研究顯示，青春期PBM的增加可以降低晚年OP和骨折的發生率[15]。因此，OP的預防可以從提高PBM的角度展開研究。

杜仲是我國的傳統中藥材，其主要化學成分有木脂素類、黃酮類、環烯醚萜類、酚酸類、萜類、甾體類和多糖類等，其中木脂素類大多是以PDG為代表的苷類化合物[16]。傳統觀點認為，木脂素是一種植物雌激素，具有類雌激素作用，在促進骨形成的同時又避免了雌激素可能帶來的各種不良反應[17]。本實驗首次研究了PDG對青年大鼠骨代謝的影響，結果提示PDG可能通過促進骨形成與抑制骨吸收來提高青年大鼠骨質量與骨強度。

本次實驗結果顯示，25 mg·kg-1、50 mg·kg-1的PDG都能提高生長期大鼠離體股骨骨密度和離體椎骨骨密度，且高劑量給藥組比低劑量給藥組的作用效果更好，提示PDG提高青年大鼠離體骨密度可能具有劑量依賴性；Micro CT成像分析直觀反映了骨微結構，骨微結構的好壞與骨質量的高低密切相關。Micro CT量化結果顯示，25 mg·kg-1、50 mg·kg-1的PDG均能增加骨體積分數、骨小梁數量以及骨小梁厚度，并減小骨小梁間距，且高劑量組的效果更為明顯，最大剖面圖和3D重建圖也反映了與之一致的趨勢；血清骨代謝生化指標直接反映了骨轉換率，血清骨形成指標OPG和骨吸收指標RANKL作為重要的骨轉換標志物，反映了體內骨形成和骨吸收的狀態。血清檢測顯示，50 mg·kg-1的PDG具有促骨形成和抗骨吸收的雙重作用，25 mg·kg-1促骨形成作用明顯但抗骨吸收作用并不明顯；脛骨雙熒光標記中雙熒光間的距離能從動態的角度反映骨微結構的變化，結果顯示25 mg·kg-1、50 mg·kg-1的PDG能明顯增加大青年大鼠脛骨中段雙熒光間的距離，且高劑量給藥組雙熒光間的間距大于低劑量給藥組。說明給藥組的骨礦鹽沉積增長速度相比于對照組而言有所提高，且高劑量給藥組的骨礦鹽沉積增長速度高于低劑量給藥組，提示了PDG對青年大鼠的骨形成有促進作用；BMP-2/Runx-2/OSX信號途徑與骨形成密切相關，參與調控成骨細胞的分化，OPG/RANKL信號途徑也是骨代謝過程中重要的信號途徑之一。Western blot檢測結果提示，25 mg·kg-1、50 mg·kg-1均能上調BMP-2、Runx-2、OSX與OPG的表達量，降低RANKL的表達量，這與血清的檢測結果一致。骨形成相關蛋白表達量的增加與骨吸收相關蛋白表達量的降低提示，PDG可能通過刺激骨形成與抑制骨吸收來調節骨代謝，提高青年大鼠骨質量。

Fig 7 Double fluorescent labeling of cortical bone in middle tibia fluorescent markers in each group (200×)

Fig 8 Comparison of distance between double fluorescent markers**P<0.01 vs control

Fig 9 The protein levels of BMP2，Runx-2，OSX，OPG and RANKL in each group*P<0.05，**P<0.01 vs control

綜上所述，本實驗結果初步顯示，PDG可明顯提高青年大鼠的骨密度，因而有可能通過提高峰值骨量而預防大鼠骨質疏松，且其作用機制可能與影響骨形成和骨吸收有關。這些結果表明，PDG很可能是杜仲抗骨質疏松的有效成分，應具有開發為抗骨質疏松藥物的潛力。但此種作用與其他已報道能提高峰值骨密度的天然產物或藥物相比有何優勢？PDG對于由切除卵巢引起的絕經后骨質疏松有無預防或治療作用？其作用機制如何？與其他藥物相比有何優勢？本課題組接下來將對這些問題予以研究。