轉錄組學結合蛋白質組學篩選羅漢果皂苷V緩解OVA誘導哮喘小鼠的關鍵通路

竇 童，王 娟，劉以撒，賈建鋼，陳 旭

(桂林醫(yī)學院藥學院生藥學重點實驗室，廣西 桂林 541100)

哮喘是一種復雜的肺部炎癥性疾病，發(fā)病受到遺傳因素和環(huán)境因素的雙重影響[1]。在2015年，全球大約有3.58億人患有哮喘，比1990年的1.83億有了大幅度的增長[2]。哮喘的發(fā)病率從19世紀60年代開始顯著增加[3]，已經(jīng)成為了全球范圍公共衛(wèi)生領域的重要問題。哮喘包括過敏性哮喘、非過敏性哮喘及內因性哮喘，其中過敏性哮喘最為常見[4]。哮喘患者肺部最主要的病理改變包括，肺組織炎癥細胞浸潤，如大量淋巴細胞和嗜酸性粒細胞浸潤、杯狀細胞黏液分泌過多，以及2型輔助性T細胞(type 2 helper T cell，Th2)型細胞因子，如白介素(interleukin，IL)-4、IL-5、和IL-13的過量表達[5]。Th2型細胞因子在過敏性哮喘中發(fā)揮了重要的作用，它能夠促進免疫球蛋白E(immunoglobulin, IgE)以及大量炎癥介質的生成，并誘導產(chǎn)生嗜酸性粒細胞性氣道炎癥[6]。雖然已經(jīng)研發(fā)了各種有效的治療方法，但過去十年中，過敏性哮喘的發(fā)病率及其并發(fā)癥的發(fā)生率急劇增加，使其成為呼吸系統(tǒng)疾病最常見形式之一。

羅漢果[Siraitiagrosvenorii(Swingle) C. Jeffrey]是葫蘆科一種多年生藤本植物的果實，是國家首批批準的藥用、食用藥材之一，其主要成分羅漢果皂苷V普遍具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘的作用[7]，常用于治療痰熱咳嗽、咽喉疼痛。有研究表明，羅漢果皂苷V有止咳祛痰、潤肺止咳的作用[8]，這也是羅漢果被用于止咳糖漿、止咳片等藥物的主要原因。中藥普遍具有多成分、多靶點協(xié)同作用的特點，很難從整體到組織器官、細胞和分子水平進行全面系統(tǒng)的研究，導致藥物作用靶點與機制不能明確[9]。而轉錄組和蛋白質組分別代表的是在mRNA水平和蛋白質水平的表達情況，通過轉錄組學和蛋白質組學研究能比較藥物作用靶器官或組織前后基因、蛋白質表達的變化——從蛋白質數(shù)量、種類改變到基因數(shù)量、種類改變，而探知藥物有效成分作用靶點，揭示藥物與機體間的相互作用機制，便于對藥物作用機制進行科學解釋[10]。該技術為探究羅漢果潤肺止咳作用機制提供了新方法，為羅漢果的深度研發(fā)提供實驗室依據(jù)。

本研究旨在討論羅漢果皂苷V改善卵清蛋白(ovalbumin, OVA)誘導的小鼠肺部炎癥的作用機制，我們通過整合轉錄組學和蛋白質組學數(shù)據(jù)，揭示數(shù)據(jù)所反映的內涵和規(guī)律，進而揭示哮喘的實質和羅漢果皂苷V發(fā)揮“潤肺止咳”功效的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物及藥品 羅漢果皂苷V(貨號PS0169-0500MG)購自成都普思生物科技股份有限公司，OVA(貨號S25067-25 g)購自上海源葉生物科技有限公司，6周齡BALB/C 雌性小鼠24只(20 ± 2)g來自斯萊克景達實驗動物有限公司(批號GLMC202005026)。動物被飼養(yǎng)在溫度(20 ± 2)℃、濕度50%± 10%可控的環(huán)境中，并進行12/12 h的光/暗循環(huán)，飼料和水可自由供應。

1.1.2主要試劑 蘇木精和1%伊紅醇溶液染色試劑盒(貨號G1120)購自北京索萊寶物科技有限公司；RNAzol(貨號G1120)購自北京天根生化科技有限公司；文庫質檢試劑盒(貨號5067-4626)購自美國Agilent Technologies公司；RNA Nano6000試劑盒(貨號5067-1511)購自美國Agilent Technologies公司；NEBNext?UltraTMRNA Library Prep Kit for Illumina?(貨號E7530)購自美國New England Biolabs公司；逆轉錄試劑盒(貨號A276A、A2781、A277A)購自美國Promega公司；SYBR Green PCR Master Mix(貨號GK10002)購自美國Glpbio公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號P0010)購自上海碧云天生物技術有限公司；尿素Urea(貨號U6504-1KG)購自德國Sigma公司；皮爾斯定量比色肽測定試劑盒(貨號23275)購自美國Thermofishe公司；ACN(貨號LC015-1HC)購自美國Honeywell公司；氨水(貨號32014-5)購自德國SIGMA公司；Trypsin酶(貨號V5117)購自美國Promega公司；RIPA高效組織裂解液(貨號R0010)購自北京索萊寶科技有限公司；NuPAGETM 10% Bis-Tris Protein Gels,1.0 mm, 12-well(貨號NP0302BOX)購自美國Thermo Fisher公司；NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)(貨號NP0001)購自美國Thermo Fisher公司；PI3K Rabbit mAb抗體(貨號ab133595)購自美國Abcam公司；Akt Rabbit mAb抗體(貨號ab179463)購自美國Abcam公司；p-PI3K Rabbit mAb(貨號CST4228T)購自美國Cell Signaling Technology公司，p-Akt Rabbit mAb(貨號WLP001a)購自沈陽萬類生物科技有限公司；β-actin mous mAb抗體(貨號TA-09)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；山羊抗兔IgG(貨號M21002S)，山羊抗小鼠IgG(貨號M21001XS)均購自上海Abmart生物醫(yī)藥有限公司。

1.1.3主要儀器 FastPrep-24 5G高通量組織破碎儀(美國MP Biomedicals公司)；超聲波細胞破碎儀(美國Thermo Fisher公司)；Sorvall Biofuge Stratatos冷凍離心機(美國Thermo Fisher公司)；Nanodrop 2000微量分光光度計(美國Thermo Fisher公司)；Eppendorf concentrator Plus真空干燥設備(德國Eppendorf公司)；SAVANT SPD1010真空離心濃縮儀(美國Thermo Fisher公司)；2100生物分析儀(美國Agilent 公司)；Novaseq 6000測序平臺(美國Illumina公司)；UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher公司)；EASY-nLC 1200液相色譜儀(美國Thermo Fisher公司)；XBridge C18 column 4.6 mm×250 mm, 5 μm(美國Waters公司)；Orbitrap Fusion Lumos質譜儀(美國Thermo Fisher公司)；Nanodrop One核酸微量監(jiān)測儀(美國Thermo Fisher公司)；T100 Thermal Cycler PCR儀(美國Bio Rad公司)；Infinite M200 Pro NanoQuant酶標儀(瑞士TECAN公司)；7500 Fast快速實時熒光定量PCR系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司)；電泳儀(美國Bio Rad公司)；ChemiDoc XRS+化學發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio Rad公司)

1.2 方法

1.2.1造模與給藥 用OVA和Al(OH)3誘導小鼠過敏性哮喘模型[11]。將24只小鼠分為3組：空白組(K)、模型組(C)和羅漢果皂苷V(V)給藥組，每組8只。模型組和羅漢果皂苷V給藥組小鼠分別于d 0、7和14腹腔注射0.1 mL致敏溶液(0.2 mg OVA和1 mg AL (OH)3)，空白組小鼠腹腔注射磷酸鹽緩沖生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)。模型組和羅漢果皂苷V給藥組小鼠分別于d 21～27每天用402AI超聲霧化器給予1% OVA噴霧，每組10 mL，每次40 min，空白組小鼠用PBS溶液噴霧，1% OVA噴藥30 min前，以50 mg·kg-1羅漢果皂苷V給予羅漢果皂苷V給藥組小鼠灌胃處理，空白組和模型組小鼠以PBS溶液灌胃處理。d 28～33給予給藥組50 mg·kg-1羅漢果皂苷V灌胃處理，空白組和模型組同樣以PBS灌胃處理。最后1次口服羅漢果皂苷V和PBS溶液24 h后處死小鼠。采集各組小鼠肺組織和血液。對小鼠肺組織進行組織形態(tài)學和病理學觀察，以判定是否造模成功，藥物干預是否有效。

1.2.2肺組織形態(tài)學及病理學 為了確定模型是否成功建立，對小鼠肺組織進形態(tài)學及病理學觀察。肺組織在10%中性緩沖福爾馬林溶液中固定48 h后，石蠟包埋，切片4 μm，供組織學檢查。切片用蘇木精和1%伊紅醇溶液(hematoxylin-eosin staining，HE)染色。肺切片在顯微鏡下進行觀察，拍照，評估肺部炎性細胞的浸潤。

1.2.3轉錄組學分析 通過RNA測序(RNA-seq)，從空白組、模型組和羅漢果皂苷V給藥組每組分別選擇3個肺組織樣本進行轉錄組分析。使用TRIzol試劑盒提取總RNA，用無RNA的DNase I去除污染的DNA，在Agilent 2100生物分析儀上評估RNA質量，RNA的完整性由Bioanalyzer 2100系統(tǒng)上的RNA Nano6000檢測試劑盒檢測。使用NEBNext? UltraTMRNA Library Prep Kit for Illumina?，以RNA完整性數(shù)(RNA Integrity Number, RIN)值大于7的樣本構建測序文庫，然后將這些文庫在Illumina Novaseq 6000測序平臺上測序，原始的Illumina測序數(shù)據(jù)已經(jīng)保存在NCBI短讀存檔(NCBI BioProjec: PRJNA777046)。

組與組之間的差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)篩選條件如下，對于每個轉錄區(qū)域，使用Stringtie(版本1.3.4)軟件計算每千堿基轉錄每百萬映射讀取的片段(fragments per kilobase million, FPKM)，以量化轉錄表達豐度和變化。以錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)值<0.05和|log2差異倍數(shù)(fold change, FC)|>1為表達差異顯著的閾值篩選DEGs，通過聚類分析來探討轉錄表達模式。

1.2.4蛋白質組學分析 給每組小鼠肺組織(每組3只作為生物學重復)樣品分別加入裂解液(1% SDS、8 mol·L-1尿素、1 g·L-1蛋白酶抑制劑混合物)，使用超聲細胞破碎儀均質3 min，離心后收集上清。使用BCA蛋白測定試劑盒對上清中的總蛋白進行定量，加入序列級修飾胰蛋白酶溶液(蛋白/胰酶比1 ∶50)，37 ℃，16 h將蛋白消化為肽段，并選用皮爾斯定量比色肽測定試劑盒對肽段進行定量。

肽段混合物用Ultimate 3000系統(tǒng)連接XBridge C18反向柱，進行脫鹽。除鹽凍干后的多肽在0.1%甲酸水溶液中重新溶解后，通過在線nanoospray LC-MS/MS對Orbitrap Fusion Lumos質譜儀耦合到EASY-nLC 1200系統(tǒng)進行分析，生成質譜檢測原始數(shù)據(jù)(ProteomeXchange ID: PXD029664)。分析柱為Acclaim PepMap C18, 75 μm×15 cm；以120 min梯度分離：5% B至35% B(B: 0.1%甲酸ACN溶液)；柱流量維持在200 nL·min-1，電噴霧電壓為2 kV。

使用Spectronaut X對DIA的原始數(shù)據(jù)進行處理和分析。歸一化處理蛋白質組學數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)在肽水平和蛋白水平上進行l(wèi)og2轉化和分析，觀察到的倍變率的統(tǒng)計學意義通過單樣本t檢驗來確定。差異表達蛋白(differentially expressed protein, DEPs)的選取以|log2FC|>1.5進行，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

1.2.5差異基因和差異蛋白的趨勢分析及通路富集分析 對空白、模型及給藥3組樣本的基因表達上下調模式進行聚類，聚類結果可得到多種符合一定生物學特性(如KC相比上調CV相比下調)的基因集。通過ShortTime-series Expression Miner[12]軟件，輸入所有差異基因的表達量(按生物學邏輯將樣品順序排好)的文件，然后選擇參數(shù)(genome: -pro 20 -ratio 1.000 0 [log2(2)=1, log2(1.5)=0.584 962 5, log2(1.2)=0.263 034 4]; proteome: -pro 20 -ratio 0.585 0 [log2(2)=1, log2(1.5) =0.584 962 5, log2(1.2)=0.263 034 4])進行趨勢分析。然后對各個趨勢中的基因進行KEGG功能富集分析，并通過假設檢驗計算得到Pvalue。得到的Pvalue通過FDR校正之后，以Qvalue ≤ 0.05為閾值，滿足此條件的Pathway定義為在該趨勢中明顯富集的Pathway。

1.2.6實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR) 使用RNAzol從各小鼠肺組織中提取總RNA，用NanoDrop One/OneC核酸微量監(jiān)測儀分析其濃度，用逆轉錄試劑盒將總RNA的3 μg反轉錄為互補cDNA，用SYBR Green PCR Master Mix和基因特異性引物(不同引物退火溫度見 Tab 1)對其進行q-PCR擴增。q-PCR采用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR系統(tǒng)。q-PCR完成后，通過ABI 7500 fast v2.0.1軟件獲得Ct值。采用2-△△Ct法表征mRNA的相對表達水平。

Tab 1 Primers involved in Real-Time PCR

1.2.7蛋白質免疫印跡(Western blot) 使用RIPA高效組織裂解液對小鼠肺組織樣本進行提取。蛋白質通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉移到硝酸纖維素膜上。用5%脫脂牛奶進行封閉，然后與目的蛋白對應的一抗在4 ℃下孵育過夜。然后將膜與相應的二抗在室溫下孵育1 h。膜用增強化學發(fā)光檢測試劑處理后顯影，發(fā)光，使用Image Lab軟件進行蛋白密度測定。

2 結果

2.1 羅漢果皂苷V對OVA誘導的哮喘模型小鼠肺部的影響肺組織形態(tài)學觀察(Fig 1A)顯示，與空白組相比，模型組表現(xiàn)出明顯的充血和肺容積增加，但給藥組的這些情況較模型組明顯改善。肺組織病理學觀察(Fig 1B)表明，與空白組比較，模型組肺泡間質增寬，有大量炎性細胞浸潤，有明顯的肺纖維化，與模型組比較，給藥組炎性細胞浸潤明顯減少，肺泡間質變薄，表明我們造模成功，且羅漢果皂苷V能夠改善OVA誘導的小鼠肺部炎癥反應。

Fig 1 Lung histopathological observation and pathological observation

2.2 羅漢果皂苷V對OVA誘導的哮喘模型小鼠轉錄水平上的影響我們的轉錄組分析結果顯示，在空白、模型和給藥組小鼠中，分別平均有6 885、7 062和6 882萬個高質量的clean reads。在所有的clean reads中，每組分別有2 020 810.67(空白組)、2 528 500.67(模型組)和2 154 898個mapped reads(給藥組)平均以97.06%的映射比率映射到小鼠基因組。這些結果表明，我們的RNA-seq數(shù)據(jù)有足夠的深度來檢測大多數(shù)表達基因和轉錄本，用于后續(xù)的定量分析。計算每兩個樣品之間的皮爾斯(pearson)相關系數(shù)，以熱圖(Fig 2A)形式展示任意兩個樣品之間的相關性。RNA-seq檢測后，實驗分析閾值為log2(Fold Change)≥ 0.58，且Pvalue<0.05的條件下共篩選出1 122個差異表達基因，分析其趨勢發(fā)現(xiàn)，在空白與模型組比較上調且模型與給藥組比較下調的基因有454(profile 5)個，反之，有111個(profile 2)(Fig 2B)，對所有的趨勢進行KEGG分析，排在前十的通路如圖所示(Fig 2C)。

2.3 羅漢果皂苷V對OVA誘導的哮喘模型小鼠蛋白水平上的影響我們的蛋白質組分析結果顯示，共鑒定出86 399個肽段，67 914個獨特肽段，最終鑒定出12 367個蛋白，所有蛋白定量熱圖如下所示(Fig 3A)。根據(jù)蛋白定量的結果，以| log2FC | > 1.5，校正P值得到的Qvalue < 0.05的條件篩選得到了497個差異表達蛋白，對其趨勢分析發(fā)現(xiàn)，在空白與模型組比較上調且模型與給藥組比較下調的基因有238個(profile 5)，反之，有91個(profile 2)(Fig 3B)，對所有的趨勢進行KEGG分析，排在前十的通路如圖所示(Fig 3C)。

2.4 羅漢果皂苷V通過調節(jié)PI3K/Akt信號通路改善OVA誘導肺部炎癥的驗證比較轉錄組和蛋白質組趨勢分析的KEGG結果發(fā)現(xiàn)，這些關鍵信號通路聚焦到吞噬體(phagosome)、EB病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、肺結核(tuberculosis)以及內磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸激酶信號通路(phosphatidylinositide 3-OH kinases/Akt singaling pathway, PI3K/Akt singaling pathway)4類信號通路。對轉錄組與蛋質白組的KEGG結果進行比較分析發(fā)現(xiàn)他們的通路上都共同富集到以下差異表達基因——Ighg1，Igha，Ighm，Ighv2-5(Tab 2)，且這4個基因位于趨勢圖的模塊5中，即為給藥后下調造模所致上調的基因，基于此并聯(lián)合通路上的關鍵因子PI3K，Akt進行分子水平上的驗證。qRT-PCR結果表明，與空白組相比，模型組Igha、Igh1、p85、Akt水平明顯上升，與模型組相比，給藥組其水平明顯降低(Fig 4A)，表明羅漢果皂苷V確實通過調節(jié)通路上關鍵因子調節(jié)小鼠哮喘，且提示羅漢果皂苷V可能通過抑制PI3K/Akt通路緩解小鼠哮喘。Western blot結果顯示，與空白組相比，模型組p-PI3K和p-Akt水平明顯上升，給藥后其水平明顯降低(Fig 4B)，進一步從蛋白水平上驗證羅漢果皂苷V通過抑制PI3K/Akt通路的激活改善OVA誘導的小鼠哮喘。

Fig 2 Effects of mogroside V on transcriptional level in OVA-induced asthmatic mice

Tab 2 Comparative analysis of differentially expressed genes/proteins in PI3K/Akt pathway based on transcriptome and proteome

3 討論

轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學相結合的方法在研究中藥治療作用機制方面變得越來越重要，這很可能會改變我們研究復雜疾病發(fā)展的方式，也可能會成為中藥藥理學與藥效學研究的重要方法。羅漢果是我國著名的治療咳嗽、咽喉痛、哮喘、胃炎和便秘的傳統(tǒng)中藥[13]。然而，其活性成分羅漢果皂苷V在OVA誘導的肺部炎癥中的作用及內在機制研究少之又少，因此，本研究采用藥效學和轉錄組學、蛋白質組學數(shù)據(jù)聯(lián)合分析相結合的方法，探索羅漢果皂苷V改善OVA誘導的小鼠肺部炎癥的作用機制。

我們首選建立了OVA誘導的哮喘小鼠模型，并進一步用羅漢果皂苷V干預哮喘模型小鼠并觀察其肺部炎癥的改善情況。在我們的實驗中，HE染色發(fā)現(xiàn)OVA誘發(fā)的小鼠哮喘模型肺組織發(fā)生了明顯的病理學變化，肺組織有滲出及出血，部分肺組織實變，而羅漢果皂苷V的干預可以明顯減輕這種癥狀。PI3K/Akt信號通路在多種癌癥中發(fā)揮促癌作用[14]，在多種慢性疾病中發(fā)揮促炎作用[15]。研究顯示，miR-4485通過PI3K/Akt/mTOR途徑改善了H1N1誘發(fā)的肺部損傷[16]，另外Psg-1的缺乏會導致PI3K/Akt信號通路激活誘發(fā)小鼠肺炎[17]。我們兩組學聯(lián)合分析的結果提示，OVA誘發(fā)的肺部炎癥與PI3K/Akt通路有關，通過mRNA及蛋白水平驗證PI3K/Akt通路的活化確實參與了OVA誘發(fā)的肺部炎癥。有研究表明，歐前胡素通過PI3K/Akt信號通路對OVA的哮喘小鼠氣道重塑起到抑制作用，PI3K/Akt的酶活性在OVA誘導的小鼠哮喘模型中明顯增加，在PI3K缺失的小鼠哮喘氣道重塑模型中發(fā)現(xiàn)氣道重塑明顯減少[18]，此外，麥門冬湯抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，增強肺組織細胞自噬活性，對小鼠間質性肺炎和肺水清除有改善作用，這些研究都提示，PI3K/Akt信號通路可能是誘發(fā)肺部炎癥的重要途徑，抑制其激活可以緩解肺部炎癥的發(fā)生。多組學聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)OVA導致的PI3K/Akt通路活性的活化確實能被羅漢果皂苷V所抑制。本實驗結果表明，PI3K/Akt信號通路的確參與了OVA導致的小鼠肺部炎癥反應，同時與羅漢果的“潤肺”作用有一定的關系。

Fig 3 Effects of mogroside V on protein levels in OVA-induced asthmatic mice

Fig 4 Expression levels of Igha, Ighg1, PI3K and Akt by qRT-PCR and Western

本研究僅在動物水平、組學水平及分子水平進行初步和系統(tǒng)的探索，PI3K/Akt通路下游mTOR涉及免疫細胞炎癥相關因子的表達，其產(chǎn)生的免疫調控及免疫抑制作用與炎癥的關系，及其更詳細的機制尚需深入研究。