松油烯-4-醇對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性行為的影響及其機(jī)制

楊 艷 ，吳映敏， 曾智銳，李 連，張 毅，陳騰祥

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004; 2. 貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院輸血科，貴州 都勻 558000；3. 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550004)

在我國(guó)，結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是一種發(fā)病率及惡性程度極高的惡性腫瘤。根據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的最新全球癌癥數(shù)據(jù)，2020年結(jié)直腸癌的發(fā)病率約為24.8/10萬、死亡率約為12.0/ 10萬[1]。在中國(guó)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，死亡率亦明顯增加[2]。臨床治療結(jié)直腸癌的方法以手術(shù)治療為主，而化療為中晚期結(jié)直腸癌術(shù)后的最常用輔助治療方法，常用的一線化療藥物有5-氟尿嘧啶(5-FU)和鉑類[3]。然而，多數(shù)患者不良反應(yīng)較重，且化療后易復(fù)發(fā)[4]。因此，需要不斷地篩選功能化合物分子作為新藥前體供開發(fā)利用。

精油主要來源于植物且具有抗癌作用[5]。精油的主要有效成分之一為松油烯-4-醇 ( terpinen-4-ol，化學(xué)式: C10H18O，T4O)，其安全性高，已被FDA批準(zhǔn)作為上市的治療皮膚真菌病的藥物[6]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)T4O具有誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及周期阻滯的作用[7]。因此，其在腫瘤中的應(yīng)用被廣泛關(guān)注。本研究擬探討T4O對(duì)RKO與HCT116細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及作用機(jī)制，以期為T4O在結(jié)直腸癌的治療中提供有力依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO和HCT116購(gòu)于美國(guó)The Global Bioresource Center細(xì)胞庫(kù)，保存于本室。

1.1.2試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基(貨號(hào)：31800-022)、DMEM高糖培養(yǎng)基(貨號(hào)：SH30022.01)和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，貨號(hào)：AB20180213E)均購(gòu)于上海諾娃醫(yī)藥科技有限公司；CCK-8試劑盒(貨號(hào)：C0037)購(gòu)自上海瑤韻生物公司；凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：KGF004)購(gòu)自杭州昊鑫生物科技有限公司；周期檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：22845)購(gòu)自西安百螢生物科技有限公司；Transwell小室(貨號(hào)：3413)和基底凝膠(貨號(hào)：356231)購(gòu)于上海凌儀生物科技有限公司；RIPA 裂解液(貨號(hào)：abs9116)和PMSF(貨號(hào)：0754-5G)購(gòu)于索萊寶生物公司；SDS-PAGE制膠試劑盒(貨號(hào)：KGP113-8%)購(gòu)于江蘇慧智生物科技有限公司；兔源性α-tublin單克隆抗體(ER130905)和兔源性Caspase 7多克隆抗體(3010-100)購(gòu)于上海齊源生物科技有限公司；兔源性NR3C1單克隆抗體(A-AO1504a)、兔源性P21多克隆抗體(LS-C54485)、兔源性E-cadherin多克隆抗體(ABP51220)和山羊抗兔(111-005-003)二抗購(gòu)于武漢艾美捷科技生物公司；兔源性N-cadherin多克隆抗體(GTX50758)購(gòu)于上海長(zhǎng)島生物技術(shù)公司；兔源性Cyclin B1多克隆抗體(M1508-1)購(gòu)于華安生物；兔源性cleaved-Caspase7多克隆抗體(WL02360)購(gòu)于沈陽(yáng)萬類生物科技有限公司；T4O(純度>99.5%;3001)購(gòu)于合肥天健化工公司；陽(yáng)性藥物5-Fu(純度> 99.67%;HY-90006)和放線菌酮(CHX; 純度>99.86%，HY-12320)購(gòu)于武漢MCE生物公司。藥物均以二甲基亞砜配制成10 mmol·L-1的母液放于-20 ℃冰箱中。轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體3000(L3000150)購(gòu)自美國(guó)賽默飛生物公司；靶向NR3C1的小干擾RNA (si-NR3C1)和陰性對(duì)照小干擾RNA(NC)均購(gòu)自于北京易錦生物，si-NR3C1和NC序列分別為5′-ACTGGCTGTCGCTTCCTCAAT-3和5′-AACACCGAACGAGUCACGATT-3′。

1.1.3儀器 酶標(biāo)儀(型號(hào)：RT-6000)購(gòu)于上海天呈科技有限公司重慶辦事處；培養(yǎng)箱(型號(hào)：BPH-962)購(gòu)于江蘇迅迪儀器科技有限公司；流式細(xì)胞儀(型號(hào)：ACEA NovoCyte)購(gòu)于福州科遠(yuǎn)貿(mào)易有限公司；超凈臺(tái)(型號(hào)：BBS-SDC)購(gòu)于濟(jì)南泰醫(yī)生物技術(shù)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)：1025025 Rev A)購(gòu)于美國(guó)Bio-rad公司；倒置顯微鏡(型號(hào)：XD-202)購(gòu)于巴玖實(shí)業(yè)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) RKO用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)，HCT116用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)。兩種細(xì)胞均放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2)，隔日換液。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待密度匯達(dá)80%以上，消化后傳代并凍存。

1.2.2運(yùn)用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)T4O對(duì)細(xì)胞增殖的影響 結(jié)直腸癌細(xì)胞株RKO和HCT116 (均3 × 103個(gè)/孔)均勻鋪于96孔板上。用不同濃度梯度(0、1、2、4 μmol·L-1)的T4O和4 μmol·L-1的5-Fu處理上述細(xì)胞，每種細(xì)胞的復(fù)孔數(shù)為6個(gè)；24 h后，配制CCK-8檢測(cè)液(CCK-8 液與含 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基以1 ∶9比例混勻)，棄原培養(yǎng)基，每孔加上述檢測(cè)液100 μL，再次放入養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 h。開啟酶標(biāo)儀，波長(zhǎng)調(diào)為450 nm，讀取OD值。每種細(xì)胞的相對(duì)增殖百分比為實(shí)驗(yàn)組OD值與空白組OD值的差值除對(duì)照組OD值與空白組OD值的差值的百分比。

1.2.3克隆平板實(shí)驗(yàn)檢測(cè)T4O對(duì)各細(xì)胞克隆形成能力的影響 RKO和HCT116(1 × 103個(gè)/孔)均勻接種于6孔板中。培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，貼壁后用不同濃度的(0、1、2、4 μmol·L-1)的T4O和4 μmol·L-1的5-Fu處理上述細(xì)胞。培養(yǎng)14 d后，換液后用含4 %的多聚甲醛溶液固定20 min，再用0.5%結(jié)晶紫常溫染色25 min。干燥處風(fēng)干并拍照，計(jì)算上述細(xì)胞的克隆形成數(shù)并記錄。

1.2.4運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T4O對(duì)上述細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO和HCT116(均3×105個(gè)/孔)接種于6孔板中。待細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁后，分別用不同濃度(0、1、2、4 μmol·L-1)的T4O和4 μmol·L-1的5-Fu處理上述細(xì)胞。24 h后，用無EDTA的胰酶消化細(xì)胞后，以含10%濃度的FBS中和后，收集于1.5 mL的離心管中。1 000 r·min-1離心5 min，PBS洗滌2次后，轉(zhuǎn)移至流式專用管(黑色)中。加入含2.5 μL Annexin V和5 μL PI的binding buff液，在室溫孵育30 min后，流式細(xì)胞儀中檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。凋亡率為細(xì)胞位于右上和右下象限的比例。

1.2.5利用流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)T4O對(duì)各細(xì)胞周期的影響 RKO和HCT116均勻鋪于6孔板中(3×105個(gè)/孔)。待細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁后，分別用不同濃度的T4O(0、1、2、4 μmol·L-1)和4 μmol·L-1的5-Fu處理上述細(xì)胞。24 h后，用無EDTA的胰酶消化細(xì)胞后，以含10%濃度的FBS中和后，收集于1.5 mL的離心管中。1 000 r·min-1離心5 min，PBS洗滌2次后，加入75%的乙醇并在-20 ℃的環(huán)境中放置24 h。離心后棄乙醇，PBS洗滌2次，轉(zhuǎn)移細(xì)胞至流式專用管(黑色)中，加入PI檢測(cè)液。常溫培養(yǎng)30 min，流式細(xì)胞儀測(cè)不同細(xì)胞在生長(zhǎng)周期(G1、S和G2/M期)中的比率。

1.2.6劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)T4O對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移能力的影響 結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO和HCT116(均2×105個(gè)/孔)均勻鋪于6孔板內(nèi)。細(xì)胞狀態(tài)佳且密度達(dá)95%～100%時(shí)，饑餓處理(無血清培養(yǎng))24 h。10 μL槍頭輕劃一直線，PBS清洗3次，需拍下0 h各細(xì)胞的劃痕圖片，分別用不同濃度的T4O(0、1、2、4 μmol·L-1)和4 μmol·L-1的5-Fu處理上述細(xì)胞，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)24 h，換液后再次拍下圖片。精確測(cè)量劃痕0 h和劃痕24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的面積(ImageJ軟件測(cè)量)，計(jì)算同一處理組 0 h與24 h的劃痕面積之差即為24 h 內(nèi)劃痕的愈合面積。各藥物濃度處理組24 h內(nèi)劃痕愈合面積與對(duì)照組24 h內(nèi)劃痕愈合面積的百分比即為相對(duì)遷移率。

1.2.7Transwell檢測(cè)經(jīng)T4O處理后細(xì)胞的侵襲能力 在Transwell上室中鋪Matrigel膠，分別鋪300 μL的RKO和HCT116的細(xì)胞懸液(含4×105個(gè)細(xì)胞)，上室中細(xì)胞用T4O(0、1、2、4 μmol·L-1)和4 μmol·L-1的5-Fu處理。下室加入700 μL含10% FBS的完全培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)24 h，棄舊液，4 %多聚甲醛常溫固定25 min，0.5%結(jié)晶紫常溫染色30 min，PBS洗3次，風(fēng)干。計(jì)數(shù)細(xì)胞侵襲數(shù)(顯微鏡放大100倍隨機(jī)拍取4個(gè)視野)。

1.2.8免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、p21、Cyclin B1、Cleave-Caspase7和NR3C1蛋白的表達(dá) RKO和 HCT116分別用RIPA(含1% PMSF)裂解細(xì)胞，定量后用Loading buff進(jìn)行樣本制備。每孔加入25 μg蛋白樣本，行SDS-PAGE分離，濕轉(zhuǎn)發(fā)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h。分別加入E-Cadherin抗體、N-Cadherin抗體、CyclinB1抗體、p21抗體、Caspase7抗體(稀釋度1 ∶1 000)、cleaved-Caspase7抗體(稀釋度1 ∶500)、α-tublin單克隆抗體(稀釋度1 ∶2 000)和NR3C1單克隆抗體(稀釋度1 ∶1 000)等抗體，4 ℃下孵育18 h。PBST清洗。用相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，PBST洗滌，化學(xué)發(fā)光法曝光，檢測(cè)各蛋白條帶的灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9T4O靶點(diǎn)分析 根據(jù)T4O的藥效團(tuán)，利用在線工具Swissprediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)和TargetNet(http://targetnet.scbdd.com/)分析預(yù)測(cè)T4O的蛋白靶點(diǎn)。此外，T4O作用靶點(diǎn)在Cytoscape軟件(version)中生成。進(jìn)一步對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算機(jī)分子對(duì)接分析，計(jì)算靶點(diǎn)與T4O的結(jié)合得分。計(jì)算機(jī)分子操作步驟如下：(1)從Protein Data Bank(https://www.rcsb.org/)和PubMed compound(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/11230)中下載NR3C1蛋白(檢索代號(hào)：5NFP)和T4O的3D結(jié)構(gòu)圖。在Autodock軟件中，清除原配體后，進(jìn)行柔性對(duì)接。結(jié)合得分負(fù)值越大則結(jié)合時(shí)釋放能量越多，結(jié)合越穩(wěn)定。

1.2.10免疫印跡檢測(cè)NR3C1蛋白的降解率 用100 μg·L-1放線菌酮(CHX)抑制RKO和 HCT116細(xì)胞的蛋白翻譯，同時(shí)分別給予等體積DMSO和2 μmol·L-1T4O處理0、1、2和4 h后，RIPA裂解細(xì)胞，提取蛋白樣本，行免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Rko和 Hct116細(xì)胞經(jīng)DMSO和T4O處理后每個(gè)時(shí)間段NR3C1的蛋白水平變化。

1.2.11細(xì)胞轉(zhuǎn)染 結(jié)腸癌RKO和HCT116細(xì)胞鋪于6孔板中，待匯合度達(dá)到60%～70%時(shí)，棄掉原來培養(yǎng)基，更換成新鮮的培養(yǎng)基。用2.5 μL的脂質(zhì)體3000分別與2.5 μL的NC和si-NR3C1配成轉(zhuǎn)染混合液。各孔分別加入NC和si-NR3C1轉(zhuǎn)染混合液后，在37 ℃培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)基。

1.2.12劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默NR3C1對(duì)T4O介導(dǎo)的遷移抑制的影響 NC和si-NR3C1組結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO和HCT116(均2×105個(gè)/孔)均勻鋪于6孔板內(nèi)。細(xì)胞狀態(tài)佳且密度達(dá)95%～100%時(shí)，饑餓處理(無血清培養(yǎng))24 h。10 μL槍頭輕劃一直線，PBS清洗3次，需拍下0 h各細(xì)胞的劃痕圖片，分別以4 μmol·L-1的T4O和等體積DMSO處理上述細(xì)胞24 h。余步驟同“1.2.6”項(xiàng)。

1.2.13CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默NR3C1對(duì)T4O介導(dǎo)的增殖抑制的影響 NC和si-NR3C1組RKO和HCT116 (均3×103個(gè)/孔)細(xì)胞均勻鋪于96孔板上。以4 μmol·L-1的T4O和等體積DMSO處理上述細(xì)胞24 h，每種細(xì)胞的復(fù)孔數(shù)為6個(gè)。余步驟同“1.2.2”項(xiàng)。

2 結(jié)果

2.1 T4O抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO和HCT116的增殖Fig 1 CCK-8 檢測(cè)結(jié)果顯示，用濃度為0(DMSO)、1、2和4 μmol·L-1的T4O以及4 μmol·L-15-Fu處理細(xì)胞，24 h后，各組RKO細(xì)胞的相對(duì)增殖率分別為(100±7.0) %、(73.8±8.6) %、(59.2±7.1) %、(47.6±3.5) %和(59.5±2.0)%;各組HCT116細(xì)胞的相對(duì)增殖率分別為(100±12.5) %、(85.9±13.4) %、(73.4±9.6) %、(45.5±1.4) %和(59.7±2.7)%。與對(duì)照組相比，T4O處理后的RKO和HCT116細(xì)胞，增殖率明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；與4 μmol·L-15-Fu的陽(yáng)性藥物處理組相比，4 μmol·L-1的T4O處理組細(xì)胞的增殖率明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。結(jié)果提示，T4O明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO和HCT116的增殖，且較陽(yáng)性藥5-Fu明顯。

2.2 T4O抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO和HCT116的克隆形成能力如Fig 2顯示，用0、1、2和4 μmol·L-1的T4O以及4 μmol·L-15-Fu分別處理RKO和HCT116細(xì)胞14 d后，各組RKO細(xì)胞克隆形成數(shù)依次為(491±38)個(gè)、(408±34)個(gè)、(312±39)個(gè)、(220±27)個(gè)和(350±36)個(gè)；各組HCT116細(xì)胞克隆形成數(shù)依次為(520±43)個(gè)、(440±36)個(gè)、(325±40)個(gè)、(85±13)個(gè)和(370 ±35)個(gè)。相比較于對(duì)照組，T4O處理過的細(xì)胞，克隆形成數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；與4 μmol·L-1的5-Fu陽(yáng)性藥處理組相比，4 μmol·L-1的T4O處理組細(xì)胞的克隆形成能力明顯減少，差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。結(jié)果提示，T4O明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO和HCT116的克隆形成能力，且較陽(yáng)性藥5-Fu明顯。

Fig 1 Effects of different concentrations of T4O on proliferation of human colorectal cancer cells RKO and HCT116 detected by CCK-8 assay n=3)

2.3 T4O促進(jìn)RKO和HCT16的凋亡凋亡檢測(cè)結(jié)果(Fig 3)顯示，用濃度分別為0、1、2和4 μmol·L-1的T4O以及4 μmol·L-1的5-Fu處理細(xì)胞24 h后，各組RKO細(xì)胞凋亡率分別為(3.06±0.51) %、(6.70±0.92) %、(9.20±1.32) %、(20.00±2.41) %和(15.59±1.6) % ; 各組HCT16細(xì)胞凋亡率分別為( 1.98±0.20) %、(3.97±0.41) %、(7.55±0.76) %、(19.42±1.9) % 和(8.17±0.8)%。T4O處理組與對(duì)照組相比，其凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0. 05；與4 μmol·L-15-Fu 的處理組相比，4 μmol·L-1的T4O處理組細(xì)胞凋亡明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0. 05。結(jié)果提示，T4O 明顯促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO和HCT116的凋亡，且較陽(yáng)性藥5-Fu顯著。

Fig 2 Effects of T4O on colony formation of human colorectal cancer cells RKO and HCT116 detected by colony formation assay n=3)

Fig 3 Effects of T4O on apoptosis of RKO and HCT116 detected by flow cytometry n=3)*P<0.05,**P<0. 01 vs control, ##P<0. 01 vs 5-Fu.

2.4 T4O誘導(dǎo)RKO和HCT116阻滯在G1期流式細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Fig 4)顯示，用0、1、2和4 μmol·L-1的T4O以及4 μmol·L-1的5-Fu處理細(xì)胞24 h后，各組RKO細(xì)胞在G1期的百分比分別為(41.98±2.3) %、(44.63±2.6) %、(47.22±2.7) %、(57.54±3.1) %和(47.26±2.1) %，在S期的百分比分別為(40.93±1.9) %、( 36.23±1.6) %、(36.04±1.5) %、(25.33±1.3) %和(40.52±2) %，在G2/M期的百分比分別為(15.54±0.7) % 、(16.68±0.8) %、(15.12±0.7) %、(16.58±0.8) %和(8.91±3.3) %；各組HCT16細(xì)胞在G1期的百分比分別為(43.80±2.3) %、(53.51±2.8) %、(54.28±2.9) %、(62.18±3.3)%和(47.5±3.2)%，在S期的百分比分別為(30.32±2.0) %、(23.86±1.9) %、(18.18±1.6) %、(14.05±1.4) %和(38.9 ±3.1) %，在G2/M期的百分比分別為(18.42±1.7) %、(18.46±1.7) %、(19.72±1.8) %、(18.41±1.7) %和(13.4±2.1) %。與各細(xì)胞系的對(duì)照組相比，不同濃度的T40處理后，RKO和HCT116在G1期的細(xì)胞比例明顯增加，在S期的比例明顯減少。差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P均<0.05；與4 μmol·L-15-Fu的處理組相比，4 μmol·L-1的T4O處理組細(xì)胞的G1期細(xì)胞比例明顯增加，差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0. 01。提示，T4O誘導(dǎo)直腸癌細(xì)胞RKO和HCT116阻滯在G1期，且其作用較同濃度5-Fu明顯。

2.5 T4O明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO和HCT116的遷移Fig 5劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將0、1、2和4 μmol·L-1的T4O以及4 μmol·L-1的5-Fu 處理細(xì)胞24 h后，各組RKO細(xì)胞的相對(duì)遷移率分別為(100±14.2) %、(75.5±9.6) %、(69.8±3.9) %、(28.7±3.9) % 和(64.1±6.3) %；各組HCT116細(xì)胞的相對(duì)遷移率分別為(100±4.3) % 、(72.3±1.9) %、(43.8±3.2) %、(6.1±1.9) %和(67.0±7.0) %。與對(duì)照組相比，T4O處理組細(xì)胞遷移率減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；與4 μmol·L-1的5-Fu的處理組相比，4 μmol·L-1的T4O處理組細(xì)胞的遷移能力明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。結(jié)果提示，T4O明顯減少結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO和HCT116的遷移能力，且較陽(yáng)性藥5-Fu顯著。

Fig 4 Effects of T4O on cell cycle of RKO and HCT116 cells detected by flow cytometry n=3)*P<0. 05, **P<0. 01 vs control, ##P<0. 01 vs 5-Fu.

2.6 T4O明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO和HCT116的侵襲能力Fig 6 Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用濃度為0、1、2和4 μmol·L-1的T4O以及4 μmol·L-15-Fu處理RKO和HCT116細(xì)胞，24 h后，各組RKO細(xì)胞每視野下侵襲過膜的細(xì)胞數(shù)為(720±42)個(gè)、(460±28)個(gè)、(300±19)個(gè)、(40±4)個(gè)和(200±25)個(gè)；各組HCT116細(xì)胞侵襲過膜的細(xì)胞數(shù)為(540±34)個(gè)、(392±23)個(gè)、(322±21)個(gè)、(76±9)個(gè)和(350±31)個(gè)。與對(duì)照組相比，T4O處理組侵襲細(xì)胞數(shù)量均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)；與4 μmol·L-1的5-Fu的處理組相比，4 μmol·L-1的T4O處理組細(xì)胞的侵襲能力明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。結(jié)果提示，T4O 明顯減少結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO和HCT116的侵襲能力，且較陽(yáng)性藥5-Fu明顯。

2.7 T4O對(duì)E-Cadherin、N-Cadherin、CyclinB1、P21、cleaved-Caspase7表達(dá)的影響用不同濃度(0、1、2、4 μmol·L-1) 的T4O以及4 μmol·L-15-Fu處理結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO和HCT16后，F(xiàn)ig 7免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各濃度T4O處理組N-Cadherin和CyclinB1的相對(duì)表達(dá)量均見明顯減少， E-Cadherin、p21和cleaved-Caspase7蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)；此外，與4 μmol·L-1的5-Fu處理組相比，4 μmol·L-1的T4O處理組N-Cadherin和CyclinB1的相對(duì)表達(dá)量均見明顯減少，E-Cadherin和cleaved-Caspase7蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。

2.8 NR3C1可能為T4O的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)根據(jù)T4O的藥效團(tuán)，我們利用在線軟件 Swissprediction與TargetNet，預(yù)測(cè)T4O可能的作用靶點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T4O有10個(gè)可能的作用靶點(diǎn)(Fig 8A-B)。其中，T4O與NR3C1的對(duì)接結(jié)合分?jǐn)?shù)最高，為(Fig 8C，Tab 1)。提示，NR3C1可能是T4O的重要作用靶點(diǎn)。

Fig 5 Effects of T4O on migration of human colorectal cancer cells RKO and HCT116 determined by wound healing assay ( × 40) n=3)

Black lines indicated 50 μm.*P<0. 05;**P<0. 01vscontrol;##P<0. 01vs5-Fu.

Fig 6 Effects of T4O on invasion of T4O on RKO and HCT116 cells determined by Transwell invasion assay ( × 40) n=3)

Fig 7 Effects of T4O on protein level of E-Cadherin, N-Cadherin, CyclinB1, p21, cleaved-Caspase7 and Caspase7 in RKO and HCT116 cells detected by Western blot n=3)

2.9 T4O增加NR3C1的表達(dá)及蛋白穩(wěn)定性基于NR3C1可能是T4O的重要靶點(diǎn)，我們探究T4O對(duì)結(jié)直腸癌RKO和HCT116細(xì)胞中NR3C1蛋白的表達(dá)影響。結(jié)果提示(Fig 9A)，T4O處理后NR3C1蛋白的表達(dá)量明顯增加。此外，通過CHX抑制蛋白的合成，我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，T4O處理后NR3C1蛋白的降解率明顯降低(Fig 9B)。提示，T4O具有增加NR3C1蛋白穩(wěn)定性的作用。

2.10 沉默NR3C1能夠緩解T4O介導(dǎo)的遷移和侵襲抑制通過構(gòu)建NR3C1沉默細(xì)胞株，我們發(fā)現(xiàn)si-NR3C1能夠明顯抑制T4O介導(dǎo)的NR3C1表達(dá)量的增多(Fig 10A)。通過劃痕實(shí)驗(yàn)(Fig 10B-C)，我們發(fā)現(xiàn)NC+DMSO、NC+T4O和si-NR3C1+T4O組RKO細(xì)胞的遷移率分別為(100±15.2) %、(48.7±9.3) %和(73.7±9) %；NC+DMSO、NC+T4O和si-NR3C1+T4O組HCT116細(xì)胞的遷移率分別為(100±9.4) %、(50±4.6) %和(90±2.6) %;與NC+T4O組相比，si-NR3C1+T4O組細(xì)胞的遷移率均明顯增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。此外，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)(Fig 10D)，我們發(fā)現(xiàn)，NC+DMSO、NC+T4O和si-NR3C1+T4O組RKO細(xì)胞的增殖率分別為(100±6.4) %、(58.6±4.3) %和(92.5±7.4) %；NC+DMSO、NC+T4O和si-NR3C1+T4O組HCT116細(xì)胞的增殖率分別為(99.6±3.1) %、(56.1±3) %和(84.7±3) %；與NC+T4O組相比，si-NR3C1+T4O組細(xì)胞的增殖率均明顯增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示，沉默NR3C1的表達(dá)能夠明顯緩解T4O介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和增殖抑制。

Tab 1 Docking score between T4O and each target

3 討論

結(jié)直腸癌患者的5年生存率低，中晚期患者多低于30%。當(dāng)前，放化療行手術(shù)切除是結(jié)直腸癌臨床治療的主要措施。放化療殺滅或抑制腫瘤，提高治愈機(jī)會(huì)，但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致患者機(jī)體免疫力的下降，腫瘤易復(fù)發(fā)[8]。此外，放化療導(dǎo)致的肝腎心等副作用較多。相對(duì)而言，有些中醫(yī)藥可發(fā)揮抗腫瘤作用，同時(shí)提高患者的免疫力[9]。因此，從中藥或其他天然產(chǎn)物中挖掘有效抗結(jié)直腸癌成分，開發(fā)結(jié)直腸癌治療藥物，是值得探索的治療方法。

T4O是中藥姜黃的有效成分之一[10]，已經(jīng)通過FDA批準(zhǔn)，成為抗寄生蟲感染及治療皮膚真菌病的藥物，在臨床上廣泛應(yīng)用；此外，T4O有較高的安全性，可內(nèi)服和外用[11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，T4O亦具有良好的抗腫瘤作用。T4O可通過抑制P-膜蛋白的表達(dá)，減少黑色素瘤對(duì)化療藥物的耐受性[12]。T4O可誘導(dǎo)人白血病HL-60細(xì)胞出現(xiàn)過度自噬，進(jìn)而導(dǎo)致凋亡[13]。本研究在結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO及HCT116中進(jìn)行的細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)T4O 可抑制RKO及HCT116的惡性生物學(xué)能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞阻滯在G1期，且在同濃度下較陽(yáng)性藥物5-Fu明顯。研究表明，T4O具有良好的體外抗結(jié)直腸癌活性。

Fig 8 Prediction of target proteins of T4O action(A-B) and molecular docking between T4O and NR3C1( C).

Fig 9 Effects of T4O on protein level and degradation rate of NR3C1 in RKO and HCT116 cells detected by Western blot n=3)

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和計(jì)算機(jī)分子對(duì)接技術(shù)是通過生物信息學(xué)手段，預(yù)測(cè)和模擬藥物分子與靶蛋白之間的相互作用，為分子的作用提供間接證據(jù)[14]。基于T4O的藥效團(tuán)分析，本研究發(fā)現(xiàn)了T4O可能有10個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。對(duì)靶點(diǎn)與T4O進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)T4O與NR3C1的對(duì)接得分最高，提示T4O與NR3C1的結(jié)合很穩(wěn)定[15]。NR3C1基因是位于人體 5號(hào)染色體上，由9個(gè)外顯子構(gòu)成，其編碼的蛋白屬于糖皮質(zhì)激素受體，也是核激素受體超家族的一員[16]。NR3C1蛋白在多種腫瘤扮演著抑癌基因的角色，如胃癌、乳腺癌以及結(jié)直腸癌等[17]。此外，多項(xiàng)研究表明，多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控機(jī)制導(dǎo)致NR3C1蛋白在腫瘤組織的表達(dá)量明顯減少，如異常的DNA甲基化、基因突變及蛋白酶體降解等[17]。因此，誘導(dǎo)抑癌蛋白NR3C1表達(dá)增加或活性增加是治療腫瘤的一種治療策略。進(jìn)一步，我們用T4O處理結(jié)直腸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)T4O能夠明顯促進(jìn)NR3C1的表達(dá)。此外，T4O處理后，NR3C1的降解速率明顯降低。因此，我們推測(cè)：T4O可能與NR3C1結(jié)合，封閉了NR3C1上一些蛋白酶體的降解位點(diǎn)，進(jìn)而減少蛋白酶體對(duì)NR3C1的降解，進(jìn)而增加NR3C1的表達(dá)量。為進(jìn)一步探究NR3C1是否參與T4O介導(dǎo)的功能學(xué)過程，我們構(gòu)建NR3C1沉默的RKO和HCT116細(xì)胞株,通過功能學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默NR3C1的表達(dá)能夠明顯緩解T4O對(duì)結(jié)腸癌RKO和HCT116細(xì)胞遷移和侵襲的抑制。

Fig 10 Knockdown of NR3C1 relieved inhibitory effects of T4O on migration and proliferation of RKO and HCT116 cells n=3)

綜上所述，T4O可能通過延緩NR3C1蛋白的降解，進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性行為，誘導(dǎo)其凋亡和G1期阻滯。T4O具有明顯的抗結(jié)直腸癌作用，有望成為臨床治療結(jié)直腸癌的輔佐用藥之一。