吲哚美辛通過NOS3影響線粒體呼吸鏈對非小細胞肺癌的機制

尚磊晶，孫盈盈，李元海

(1.安徽理工大學附屬淮南新華醫院麻醉科，安徽 淮南 232052；2.安徽省兒童醫院麻醉科，安徽 合肥 230022；3．安徽醫科大學第一附屬醫院麻醉科，安徽 合肥 230032)

肺癌(lung cancer，LC)是全球范圍內最常見的癌癥，并且發病率呈逐年上升的趨勢。在過去的10年中，我們對肺癌的研究取得了突破性的進展，尤其是肺癌相關基因的研究。但縱使如此，肺癌仍是導致癌癥死亡的首要因素。2018年，全球腫瘤流行病統計數據估算，有大約290萬肺癌新發病例(占總腫瘤病例的11.6%)和176萬死亡病例(占總腫瘤死亡病例數的18.4%)，這遠遠高于2012年報道水平[1-2]。根據肺癌的分化程度和形態特征，將肺癌分成小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。NSCLC中最多見的是鱗狀細胞癌，其次是腺癌，還有一些少見的病理類型，例如腺鱗癌、大細胞癌、肺泡細胞癌等。

肺癌患者會發生一系列身體和心理上的問題，包括咳嗽、呼吸困難、疼痛和焦慮等，疼痛是最嚴重的癥狀之一，并且嚴重影響患者生活質量。世界衛生組織制定了癌痛三階梯鎮痛方案：第一階梯是使用非甾體抗炎藥物為主的鎮痛藥物；第二階梯是使用弱阿片類鎮痛藥物；第三階梯是使用強阿片類鎮痛藥物[3]。吲哚美辛則是屬于第一階梯鎮痛藥物，它是常用的解熱鎮痛藥物，有口服、涂抹、直腸給藥等多種給藥途徑，在臨床上有廣泛的用途。它是首批被批準用于疼痛治療的非甾體抗炎藥物之一，目前被認為是誘導早產兒動脈導管閉合的一線藥物，具有極高的安全性。此外，吲哚美辛在治療其他一些臨床疾病中也具有很好的療效，例如：腎臟痛和一些類型的頭痛，但吲哚美辛在晚期癌癥中的研究目前還是相對較少。

一氧化氮(nitric oxide，NO)是一種氣體自由基遞質，可調節機體的多種生物學功能。它是一種簡單的氣體自由基，其主要功能是通過cGMP作為細胞信號通路中的信使。在哺乳動物中，NO是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)合成的，NOS有3種亞型，分別是神經元中的NOS1(neuronal NO synthase，nNOS or NOS1)，可誘導的NOS2(inducible NO synthase，iNOS or NOS2)和內皮細胞中的NOS3(endothelial NO synthase，eNOS or NOS3)。關于NOS3的研究，之前主要集中在心血管疾病發生發展及治療中的相關作用，NOS3表達異常和功能障礙與動脈粥樣硬化發展密切相關[4]。不僅如此，NOS3促進生成的NO對預防糖尿病引起的內皮細胞功能障礙有著重要的意義[5]，但是NOS3在NSCLC中發揮著何種作用仍不清楚。

呼吸作用是生物最重要也是最基本的特征之一。線粒體參與多種重要的細胞活動，其中最為重要的是能量轉換。在很多癌癥中，由線粒體脫氧核糖核酸(mitochondrial deoxyribonucleic acid，mtDNA)突變引起線粒體呼吸鏈功能障礙導致電子泄露加劇，從而使自由基產生增加[6]。在大多數細胞中，線粒體復合物I和線粒體復合物III是細胞ROS的主要來源。在腫瘤細胞中，不斷產生的ROS作為信使刺激腫瘤細胞增殖，并作為內源性DNA損傷因素，促進遺傳變異和腫瘤的發展，因此，線粒體呼吸鏈在腫瘤的發生發展中發揮著重要的作用。本研究通過人源NSCLC細胞系NCI-H520、A549，使用不同濃度的吲哚美辛，探討吲哚美辛在NSCLC中發揮的作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 本實驗選用NSCLC細胞系NCI-H520、A549，由上海派通生物科學有限公司提供。

1.1.2試劑 吲哚美辛、L-NMMA(NOS3抑制劑)購自美國Selleck公司；胎牛血清購自澳洲Gibco公司；0.25%胰酶消化液購自北京碧云天公司；DMEM/F-12細胞培養液購自美國Hyclone公司； ATP5A、UQCRC2、SDH8、NDUFB8復合抗體(批號：ab110413)購自英國Abcam公司；β-actin(批號：bsm-33036m)購自中國博奧森公司；MitoTracker Red CMXRos探針、ECL發光試劑盒購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 使用含有10%的胎牛血清的DMEM/F12高糖培養液，將NCI-H520置于37 ℃，含有5% CO2細胞培養箱培養，當細胞匯合度至80%時進行傳代培養。

1.2.2CCK-8實驗 將NSCLC細胞A549種植于96孔板，每孔接種約1×104個細胞，細胞培養12 h后，加入不同濃度吲哚美辛(0、5、10、20、50、 100 μmol·L-1)分別在0、12、24、48 h檢測細胞增殖能力。再將NCI-H520肺癌細胞接種于96孔板，每孔接種約1×104個細胞，細胞培養12 h后，加入不同濃度吲哚美辛(10、20、30 μmol·L-1)，測定吲哚美辛對NCI-H520的抑制作用。確定吲哚美辛作用濃度后將NCI-H520、A549肺癌細胞接種于96孔板，使用不同濃度的L-NMMA(50、100 μmol·L-1)處理吲哚美辛預處理后的NCI-H520、A549細胞系，再測定細胞存活率，另設DMSO對照組，每組設置6個復孔。孵育24 h后，每孔加入100 μL CCK-8溶液，置于孵育箱孵育2 h后，使用酶標儀450 nm波長處測定各孔吸光度值(OD值)，計算各實驗孔相對存活率。實驗重復3次。

1.2.3克隆形成實驗 取對數生長期NCI-H520細胞，以每孔約500個細胞接種于6孔板中，加入不同濃度的吲哚美辛(0、10、20、30 μmol·L-1)進行處理，放置于孵育箱中培養14 d，其中每3 d更換1次培養基。4%多聚甲醛固定后，使用0.2%結晶紫染色后進行拍照，每組設置3個復孔。

1.2.4Western blot實驗 將NSCLC細胞NCI-H520接種于直徑60 mm細胞培養皿，置于孵育箱培養12 h后，加入20 μmol·L-1吲哚美辛孵育 24 h，另設對照組。24 h后，取細胞培養皿，使用PBS沖洗2遍，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細胞裂解液，冰上裂解10 min，用細胞刮刮下細胞，置于EP管中。加入1/4體積的5×SDS-PAGE，沸水水浴10 min。取蛋白量約為20 μg的樣品加入10% SDS-PAGE凝膠中電泳。隨后進行轉膜，在冰水中，電壓100 V，100 min，使用濕法轉膜方式將目的蛋白轉至PVDF膜上。轉膜完成后，5%脫脂牛奶常溫封閉2 h，TBS洗滌3遍后，放置于已稀釋的一抗中，4 ℃搖床孵育過夜。d 2，經TBS洗滌3遍后，置于二抗中，室溫孵育1 h，使用ECL發光試劑盒進行顯影，曝光后檢測各蛋白條帶的灰度值。

1.2.5免疫組化染色 組織樣品購自武漢賽維爾生物科技有限公司，組織芯片產品編號：IWLT-N-52LN93，其中肺腺癌6例，肺鱗癌26例，癌旁組織20例。取出石蠟切片，置于烘箱烘烤2 h，使用PBS沖洗3遍，再用二甲苯浸泡20 min，一共浸泡3遍。然后使用無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇分別浸泡10 min進行水化。使用95 ℃檸檬酸鈉緩沖液浸泡10 min，PBS浸泡2次，每次5 min。然后使用10%山羊血清進行封閉，置于濕盒室溫孵育1 h。隨后小心吸取封閉液，加入已稀釋好的一抗(NOS3 1 ∶200)，4 ℃孵育過夜。次日室溫復溫30 min后，使用PBS洗滌3遍，每遍10 min，隨后，使用3%的H2O2避光孵育15 min，再使用PBS洗滌3遍，每遍5 min。使用已稀釋二抗室溫孵育1 h后，使用DAB染色，置于流動的自來水沖洗2 min進行終止，再用蘇木素進行復染。將玻片置于1%氨水中進行返藍，再置于自來水沖洗2 min。最后使用二甲苯進行透明化5 min，封片后置于光學顯微鏡下觀察。由于使用ImageJ plus無法精確區分肺泡和腫瘤組織界限，故采用人工打分方式，綜合芯片結果，能夠明顯發現表達水平區別，因此未定量。

1.2.6生物信息學分析 本實驗使用STRING網站對吲哚美辛配體進行預測，結合分數>0.8有意義；使用Discovery Studio模擬吲哚美辛與NOS3結合；通過GEPIA網站分析腫瘤和癌旁組織NOS3 mRNA表達水平、腫瘤切除術后NOS3 mRNA水平和遠期生存率之間關系；通過LinkedOmics分析與NOS3富集的基因；使用KEGG分析與NOS3相關的通路。

1.2.7線粒體ROS水平 本實驗使用MitoTracker Red CMXRos探針，將探針使用DMSO配置為1 mmol·L-1的儲存液，加入處理后的肺癌細胞中，工作液濃度為100 nmol·L-1，孵育30 min。使用新鮮培養基洗去染色液，4%多聚甲醛固定后使用0.2%的Triton X-100進行透化，置于熒光顯微鏡下進行拍照。

1.2.8透射電鏡 取5 μL處理后的細胞懸液，置于銅網，使用2.5%的戊二醛溶液固定后加入3%的磷鎢酸室溫復染5 min，吸取多余復染液，純水洗滌3次，每次2 min，室溫干燥，使用電鏡拍攝照片。

2 結果

2.1 吲哚美辛通過NOS3抑制非小細胞肺癌細胞增殖通過CCK-8實驗(Fig 1A)，結果發現相較于對照組，20 μmol·L-1的吲哚美辛作用24 h即可抑制NSCLC細胞A549增殖(P<0.05)，在48 h處理組中，發現吲哚美辛的抑制作用更穩定且十分明顯。通過CCK-8、克隆形成實驗(Fig 1B、C)實驗發現，在NSCLC細胞NCI-H520中，20 μmol·L-1的吲哚美辛也具有抗癌作用以及抑制腫瘤細胞克隆形成能力。通過STRING網站預測吲哚美辛受體，結果發現NOS3與吲哚美辛有較高的結合分數(>0.98；Fig 1D、1E)。然后通過Discovery Studio進行分析，發現在NOS3蛋白內側，存在吲哚美辛的結合域(Fig 1F)。于是我們使用了NOS3抑制劑L-NMMA進行處理，結果表明，在A549和NCI-H520 NSCLC細胞系中，相較于吲哚美辛處理組，50 μmol·L-1L-NMMA均可以逆轉吲哚美辛引起的NSCLC細胞死亡(Fig 1G)(P<0.01)。以上實驗表明，吲哚美辛抑制NSCLC細胞增殖，并且其抑癌作用與NOS3的活化相關。

2.2 吲哚美辛的作用靶點分析通過GEPIA數據庫發現，相較于癌旁組織，NSCLC中NOS3 mRNA水平明顯降低(Fig 2A)(P<0.05)。在切除病灶后，NOS3高表達的患者遠期生存率較高(Fig 2B)。我們對NSCLC病患者的樣本進行免疫組化染色，比較癌旁組織和NSCLC組織的NOS3表達水平，結果發現，NSCLC組織的NOS3水平明顯低于癌旁組織(Fig 2C)。以上結果表明，NOS3在NSCLC的發展進程中起著重要作用。

2.3 NOS3與線粒體呼吸鏈高度負相關通過LinkedOmics數據庫分析，NOS3可以富集20 103個基因(Fig 3A、B)。然后我們對NOS3富集得到的基因進行KEGG分析，發現線粒體呼吸鏈功能調控通路與NOS3有較高的負相關系數(Fig 3C、D)，因此我們考慮NOS3可能通過抑制線粒體呼吸鏈來發揮抑癌作用。

2.4 吲哚美辛抑制線粒體呼吸鏈活性為了檢測線粒體功能，我們首先檢測了線粒體ROS改變，通過MitoTracker Red CMXRos探針，結果顯示相較于對照組，吲哚美辛處理組線粒體ROS明顯增多(Fig 4A、B，P<0.01)，接下來我們通過透射電鏡直觀的觀察線粒體的形態，結果提示吲哚美辛處理組線粒體數量減少、形態腫脹變形、內嵴消失(Fig 4C)。最后我們檢測了ATP5A、UQCRC2、SDH8、NDUFB8四個線粒體復合物核心蛋白，通過Western blot實驗，我們發現在20 μmol·L-1吲哚美辛作用下，相較于對照組，吲哚美辛處理組UQCRC2蛋白水平發生了明顯的降低(Fig 4D)(P<0.01)，但ATP5A、SDH8、NDUFB8蛋白水平沒有發生明顯改變。這提示吲哚美辛可能通過UQCRC2影響線粒體呼吸鏈功能。

3 討論

肺癌是世界上最常見、最致命的腫瘤之一，中國是世界上肺癌患者最多的國家之一，雖然肺癌治療取得了極大的進展，但肺癌患者的生存率仍不容樂觀。約有80%的肺癌患者患有肺鱗狀細胞癌，且在確診時已經是晚期，并伴有轉移，預后不良[7]。因此，如何改善這類患者的生存質量是一個很值得探討的問題。吲哚美辛是臨床上常用的解熱鎮痛藥物，之前很多研究表明，吲哚美辛不僅具有良好的解熱鎮痛效果，還具有一定的抗癌作用。在前列腺癌中，吲哚美辛激活未折疊蛋白反應和凋亡通路，促進p53蛋白表達，并抑制細胞周期、Myc基因表達和AR/ARV7通路[8]。在結直腸癌中，吲哚美辛可降低炎癥因子水平，激活凋亡通路從而發揮抑癌作用[9]。不僅如此，負載阿霉素的吲哚美辛二聚體納米顆粒在耐藥乳腺癌可發揮抑癌作用[10]。然而，吲哚美辛在NSCLC中的作用，目前的研究甚少，而它卻是肺癌中常用的解熱鎮痛藥物。

Fig 1 Indomethacin inhibited proliferation of non-small cell lung cancer cells by

Fig 2 Drug target analysis of indomethacin

Fig 3 NOS3 was closely associated with mitochondrial respiratory chain

本實驗采用人源NSCLC細胞系NCI-H520和A549，在不同的時間點使用不同的吲哚美辛濃度，發現20 μmol·L-1的吲哚美辛即可發揮抑癌作用。這一濃度遠低于臨床使用血藥濃度，不會產生明顯副作用。為了進一步探討吲哚美辛抑癌作用的機制，我們使用了分子靶向對接技術，分析發現NOS3與吲哚美辛關系密切，并且使用了L-NMMA(NOS3抑制劑)驗證了這一靶點。NOS3是一個比較有爭議的分子，有研究指出NOS3能夠參與NO的生成，而NO對腫瘤的進程有著重要的影響[11-12]。本研究對NOS3進行了進一步的探究，通過公共數據庫GEPIA分析發現，相較于正常人，NSCLC患者NOS3 mRNA水平明顯降低。不僅如此，在病灶切除后，NOS3高表達的患者遠期生存率更高。對患者樣本進行免疫組化染色，發現相較于癌旁組織，NSCLC組織中的NOS3蛋白水平明顯減少。這一系列的結果提示，NOS3可以抑制非小細胞NSCLC的進展，并且是吲哚美辛發揮抑癌作用的關鍵靶點。接下來我們進一步探究NOS3是通過何種途徑發揮抑癌作用，通過LinkedOmics數據庫發現線粒體呼吸鏈在其中的作用最為重要。為了驗證這一結果，我們檢測了吲哚美辛作用后線粒體ROS水平、線粒體形態，而這些結果也與我們預想的結果一致。線粒體呼吸鏈核心蛋白水平是體現線粒體功能的一個重要指標，我們通過Western blot檢測在吲哚美辛處理后線粒體呼吸鏈核心蛋白的表達情況，結果發現相較于未處理組，吲哚美辛處理組UQCRC2蛋白表達明顯降低，而其他蛋白的表達量沒有明顯的變化，所以我們認為吲哚美辛發揮抑癌作用是通過NOS3抑制UQCRC2蛋白表達從而抑制線粒體呼吸鏈。

線粒體是重要的細胞器，控制著細胞存活和死亡，越來越多的證據表明，線粒體代謝和功能在腫瘤的發展和進程中必不可少，這使線粒體及其功能成為抗腫瘤的熱門靶點。線粒體呼吸鏈由5種復合物(I-V)組成，它們傳遞電子并參與氧化還原反應。天然化合物帕普胺被證明可以抑制NSCLC細胞的ATP生成、引起線粒體功能障礙、消耗細胞內ATP和增加線粒體超氧化物合成[13]，從而誘導NSCLC細胞凋亡。UQCRC2是線粒體復合體III重要組成亞基。它可以通過微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)/UQCRC2軸調節上皮間充質轉化促進胃癌的進展[14]。此外，在膠質瘤中，鈣黏蛋白18(cadherin 18，CDH18)通過UQCRC2抑制膠質瘤細胞侵襲性并改變患者預后[15]。我們首次發現在NSCLC中，NOS3可以通過影響線粒體呼吸鏈發揮抑癌作用，它通過抑制NSCLC細胞線粒體中UQCRC2來發揮抑癌作用。有報道指出許多線粒體呼吸鏈抑制劑，例如二甲雙胍、α-生育酚琥珀酸酯和3-溴丙酮酸酯等都可以通過破壞線粒體呼吸鏈復合物功能來殺死癌細胞[16-17]，這也與我們的研究相一致。

Fig 4 Indomethacin inhibited activity of mitochondrial respiratory

綜上所述，吲哚美辛在人源NSCLC細胞NCI-H520以及A549中發揮著抑癌作用，其作用機制與調控NOS3水平，抑制線粒體呼吸鏈有關。臨床上晚期NSCLC患者眾多，而吲哚美辛作為常用的解熱鎮痛藥物應用十分廣泛，本研究從麻醉疼痛科醫師和外科醫師角度，在多種鎮痛藥物中希望選擇一個相對具有優勢的鎮痛藥物，不僅可以減緩疼痛，還具有一定的抗癌作用，為晚期NSCLC患者的臨床鎮痛藥物選擇提供了新的用藥思路。

(致謝：本實驗在安徽醫科大學第一附屬醫院麻醉科實驗室完成，感謝各位老師和同學的幫助。)