貓眼草提取物通過miR-30a-5p/NF-κB抑制白介素-1β誘導結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲

吳雄健，朱海燕，胡 瀅，黃子倩，劉曉平

(贛南醫學院第一附屬醫院 1.消化內科、2.藥學部、3.普外五科，江西 贛州 341000)

炎癥目前被認為是惡性腫瘤的診斷和評估治療方案效果的重要標志，在腫瘤的起始、進展、轉移和抗腫瘤治療的抵抗等不同階段起決定性作用[1]。多種腫瘤相關炎癥細胞會增加各種炎癥產物在癌變部位的釋放和積累，這些產物反饋性地激活腫瘤相關信號級聯反應，如信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, Stat3)、核因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)和p38絲裂原激活的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)，它們介導大量炎癥細胞的募集和促炎因子的分泌，促進及加速腫瘤細胞增殖[2]。結直腸癌(colorectal cancer, CC)是一種與局部慢性炎癥廣泛相關的疾病[3]。盡管手術及術后輔助放化療在治療結直腸癌方面取得了明顯的改善，但腫瘤發病機制較復雜導致的耐藥性給治療帶來較大的障礙，尋找新的治療靶點是治療結直腸癌乃至所有存在耐藥性的惡性腫瘤的一個重要的研究方向。靶向炎癥對于結直腸癌的防治來說是一種有吸引力的潛在策略。人們逐漸將研究方向轉至中藥，已有大量的中藥或中藥提取物被確認具有確切的抗炎抗腫瘤的效果[4]。

貓眼草是大戟科大戟屬貓眼草(EuphorbiaesulaL.)的全草，因含有內酯、萜類、黃酮類、類固醇、苯丙烷、酚類和其他化學成分，廣泛用于治療痰、咳、喘、水腫、疥癬等[5]。現代藥理研究表明，貓眼草具有多種活性，如抗腫瘤、抗菌和抗氧化活性[6]。大量研究已經證實，貓眼草提取物具有較高的抗腫瘤活性，但較少研究評估貓眼草在結直腸癌中炎癥相關的抗腫瘤作用。miR-30a-5p表達上調可抑制結直腸癌細胞的活力和侵襲，miR-30a-5p在增強結直腸癌耐藥細胞對化療藥5-氟尿嘧啶的敏感性具有重要意義。報道顯示，中藥內酯及萜類成分可通過調節miR-30a-5p表達導致結直腸癌細胞的化療耐藥性，含有內酯成分的貓眼草但miR-30a-5p是否可作為貓眼草治療結直腸癌的潛在靶點尚未可知。因此，本研究建立了結直腸癌的白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)炎癥模型，檢查貓眼草對結直腸癌的影響并探索了潛在的抗腫瘤機制。

1 材料與方法

1.1 材料結直腸癌細胞HT29(美國ATCC，貨號HTB-38)，miR-30a-5p mimic、mimic對照(miR-NC)、miR-30a-5p inhibitor(anti-miR-30a-5p)、inhibitor對照(anti-miR-NC)(上海吉瑪)，細胞計數試劑盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)(日本Dojindo，貨號CK04)，兔抗人細胞周期蛋白D1(CyclinD1)抗體 (貨號ab16663)、兔抗人基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotease，MMP)2抗體(貨號ab92536)、兔抗人MMP9抗體(貨號ab76003)、兔抗人磷酸化p65(phospho-p65，p-p65)抗體(貨號ab 83559)(美國Abcam)，RIPA裂解緩沖液(北京陽光，貨號C190419)。貓眼草藥材(亳州中藥飲片廠)以1 ∶14的比例加入50%乙醇，回流提取1 h，重復2次。合并2次濾液，濃縮并干燥，即得貓眼草提取物。將貓眼草提取物以培養基稀釋成2.5、5和10 mg·L-1的濃度備用。

1.2 細胞培養與IL-1β損傷結直腸癌細胞HT29在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中生長，培養箱飽和濕潤、含95%空氣、5% CO2，溫度為37 ℃。由預實驗和文獻[7]得出，100 μg·L-1IL-1β作用結直腸癌細胞HT29 24 h，以誘導IL-1β損傷。

1.3 實驗分組將對數生長期的結直腸癌細胞HT29分為：NC組(對照)、IL-1β組(IL-1β損傷)、低劑量(2.5 mg·L-1貓眼草提取物)+IL-1β組、中劑量(5 mg·L-1貓眼草提取物)+IL-1β組、高劑量(10 mg·L-1貓眼草提取物)+IL-1β組、miR-NC(轉染miR-NC)+IL-1β組、miR-30a-5p(轉染miR-30a-5p mimic)+IL-1β組、anti-miR-NC(轉染anti-miR-NC)+高劑量+IL-1β組、anti-miR-30a-5p(轉染miR-30a-5p inhibitor)+高劑量+IL-1β組。轉染時，結直腸癌細胞HT29以5×105/孔的密度接種在6孔板中并培養至50%～60%的匯合度，然后使用Lipofectamine 2000進行miR-NC、miR-30a-5p mimic、anti-miR-NC、miR-30a-5p inhibitor轉染。8 h后根據分組進行IL-1β損傷或/和10 mg·L-1貓眼草提取物處理。其中，貓眼草提取物作用時間為48 h。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖活性將細胞以5×103/孔的密度接種在96孔板中，并在d 2測量細胞增殖活性。每孔加入CCK-8試劑(10 μL)，37 ℃持續2 h。使用Bio-Rad酶標儀測量450 nm處的吸光度A值，細胞的增殖活性表示為A值。

1.5 克隆形成實驗檢測細胞克隆將不同組別結直腸癌細胞HT29(500個)接種到6孔板中并培養15 d。然后用甲醇固定細胞并用0.5%結晶紫染色30 min。在光學顯微鏡下計數超過50個細胞的克隆數。

1.6 Transwell法檢測細胞遷移和侵襲結直腸癌細胞HT29經不同處理后，將溶于無血清培養基的1×105個細胞鋪在24孔、8 μm Transwell板上室(侵襲測定時每孔加入40 μg Matrigel并在37 ℃下保持1 h)，下室加入500 μL含血清培養基進行遷移測定。48 h后，通過包被膜遷移(或侵襲)到下室的結直腸癌細胞HT29用甲醇固定，用1%結晶紫染色，并通過顯微鏡對每個膜的3個視野進行計數獲得遷移和侵襲數量。

1.7 Western blot檢測CyclinD1、MMP2、MMP9、p-p65蛋白表達水平結直腸癌細胞HT29經不同處理后，使用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，使用10% SDS-PAGE分離不同分子量的蛋白(30 μg/泳道)，然后將蛋白轉移到PVDF膜上。將膜與5%脫脂牛奶在室溫下孵育2 h，與CyclinD1、MMP2、MMP9、β-actin抗體(稀釋度均為1 ∶1 000)在4 ℃下過夜，然后與辣根過氧化物酶標記的二抗在37 ℃下孵育1 h，在凝膠成像系統上用增強型化學發光試劑檢測蛋白信號。同法測定NC組、IL-1β組、高劑量+IL-1β組、anti-miR-NC+高劑量+IL-1β組、anti-miR-30a-5p+高劑量+IL-1β組p-p65蛋白的表達水平，p-p65抗體稀釋度為1 ∶1 000。

1.8 qRT-PCR檢測miR-30a-5p表達水平采用TRIzol法提取結直腸癌細胞HT29總RNA，使用Nano-100微型分光光度計測量RNA濃度，收集A260/A280比為1.8～2.0的樣品進行逆轉錄。按照Taqman MicroRNA Reverse Transcription試劑盒中規定的說明，將RNA逆轉錄為cDNA。根據Taqman Universal Master Mix II試劑盒的手冊，在ABI 7500實時PCR系統進行PCR反應，測定miR-30a-5p的表達。U6作為miR-30a-5p的內參。通過比較CT值法(即2-△△CT法)對miR-30a-5p基因的相對表達進行歸一化。引物序列(5′-3′)：miR-30a-5p F: ACTCAGCTGGTGTAAACATCCTCGAC，R:TGGTGTC GTGGAGTCG，U6 F: CGCTTCGGCAGCACATATACT A，R: CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA。

Fig 1 Cell clone formation experiment

2 結果

2.1 不同濃度貓眼草提取物對IL-1β誘導的結直腸癌細胞HT29增殖活性、遷移和侵襲的抑制作用與NC組比較，IL-1β組結直腸癌細胞HT29的增殖活性升高，細胞克隆數增多，細胞遷移和侵襲數量增多(均P<0.01)。與IL-1β組比較，低劑量+IL-1β組、中劑量+IL-1β組、高劑量+IL-1β組結直腸癌細胞HT29的增殖活性降低，細胞克隆數減少，細胞遷移和侵襲數量降低(均P<0.01)。見Tab 1、Fig 1。

Tab 1 Inhibitory effects of different concentrations of Enphorbia lunulata Bge extract on proliferation, migration and invasion of HT29 cells induced by IL-1β n=9)

2.2 不同濃度貓眼草提取物對CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達水平的影響IL-1β組結直腸癌細胞HT29的CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達水平比NC組升高(均P<0.01)。低劑量+IL-1β組、中劑量+IL-1β組、高劑量+IL-1β組結直腸癌細胞HT29的CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達水平比IL-1β組降低(均P<0.01)。見Tab 2、Fig 2。

2.3 不同濃度貓眼草提取物對miR-30a-5p基因表達水平的影響IL-1β組結直腸癌細胞HT29中miR-30a-5p表達水平低于NC組(P<0.01)。低劑量+IL-1β組、中劑量+IL-1β組、高劑量+IL-1β組結直腸癌細胞HT29中miR-30a-5p表達水平高于IL-1β組(均P<0.01)。見Tab 3。

Fig 2 Expression of cyclinD1, MMP2 and MMP9 detected by Western blot

Tab 2 Effects of different concentrations of Enphorbia lunulata Bge extract on expression of CyclinD1,

##P<0.01**P<0.01vsNC；#P<0.01vsIL-1β

Tab 3 Effects of different concentrations of Enphorbia lunulataBge extract on expression of miR-30a-5p gene n=9)

2.4 miR-30a-5p對IL-1β誘導的結直腸癌細胞HT29增殖、遷移、侵襲的影響miR-30a-5p+IL-1β組結直腸癌細胞HT29的miR-30a-5p表達水平比miR-NC+IL-1β組增加約1.05倍，而CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達水平、增殖活性、細胞克隆數、遷移和侵襲數量卻比miR-NC+IL-1β組降低(均P<0.01)。見Tab 4、Fig 3。

Tab 4 Effects of miR-30a-5p on IL-1β-induced proliferation, migration, invasion and apoptosis of HT29 n=9)

Tab 5 Anti-miR-30a-5p reversed effects of Enphorbia lunulata Bge extract on proliferation, migration and invasion of HT29 induced by n=9)

Fig 3 Expression of CyclinD1, MMP2, MMP9 detected by Western blot

2.5 anti-miR-30a-5p可以逆轉貓眼草提取物對IL-1β誘導的結直腸癌細胞HT29增殖、遷移、侵襲的影響anti-miR-30a-5p+高劑量+IL-1β組結直腸癌細胞HT29的miR-30a-5p表達水平比anti-miR-NC+高劑量+IL-1β組減少約0.55倍，而CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達水平、增殖活性、細胞克隆數、遷移和侵襲數量比anti-miR-NC+高劑量+IL-1β組升高(均P<0.01)。見Tab 5、Fig 4。

2.6 NF-κB信號通路蛋白表達情況結直腸癌細胞HT29內NF-κB信號通路蛋白p-p65表達水平在IL-1β組中高于NC組；在高劑量+IL-1β組中低于IL-1β組；且p-p65表達水平在anti-miR-30a-5p+高劑量+IL-1β組中高于anti-miR-NC+高劑量+IL-1β組(均P<0.01)。見Tab 6、Fig 5。

3 討論

IL-1β是IL-1細胞因子家族的成員。多項研究已確定，IL-1β在腫瘤發生發展中的重要地位，IL-1β具有多效性，通常通過作用于癌細胞增殖和侵襲、新血管生成或腫瘤浸潤性免疫細胞而成為癌癥的啟動子[8]。IL-1β表達上調與結直腸癌患者的不良生存相關[9]。在結直腸癌中，IL-1β通過增加鋅指綁定增強蛋白1的表達來誘導細胞遷移和上皮-間質轉化[10]。本研究中，IL-1β可誘導結直腸癌細胞HT29增殖、遷移和侵襲能力的增加，表明了IL-1β對結直腸癌的致癌作用，與前述報告吻合。

Fig 4 Expression of CyclinD1, MMP2, MMP9 detected by Western blot

Fig 5 Expression level of p-p65 protein detected by Western blot

Tab 6 Expression level of p-p65 protein detected by

研究表明，貓眼草提取物通過時間和濃度依賴性方式抑制人肝癌HepG2細胞的增殖[11]。貓眼草的乙酸乙酯提取物可以抑制ZR-75-30乳腺癌細胞的生長，其中抑制率隨著藥物濃度的增加而增加[12]。我們當前的分析旨在確定貓眼草提取物對IL-1β誘導的結直腸癌發生和轉移的影響。細胞增殖失調是癌癥的標志之一，異常持續的活躍增殖信號傳導是人類腫瘤(包括結直腸癌)發展過程中經常發生的事件。本研究中，我們證明貓眼草提取物可降低IL-1β誘導的結直腸癌細胞增殖活性、克隆形成能力，并下調增殖相關蛋白CyclinD1水平。結直腸癌患者預后差和死亡率高是結直腸癌細胞高度惡性的結果[13]。因此，抑制癌癥轉移可能是改善結直腸癌患者預后的關鍵。在此，我們的結果表明，貓眼草提取物顯著抑制了IL-1β誘導的結直腸癌細胞的遷移和侵襲能力，并下調MMP2、MMP9表達。本研究初步表明，貓眼草提取物可以抑制IL-1β誘導的結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲，因此，貓眼草提取物能抑制結直腸癌中IL-1β的炎癥性致癌作用，表現出顯著的抗腫瘤活性。

研究表明，與正常對照相比，結直腸癌患者的血清miR-30a-5p水平下調，能降低結直腸癌細胞的增殖和遷移[14]。miR-30a-5p上調可以抑制卵巢癌上皮間質轉化和侵襲[15]。表明miR-30a-5p可能是治療結直腸癌等腫瘤的有希望的靶點。與這些報道類似，本研究發現miR-30a-5p的過表達可以抑制IL-1β誘導的結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲。此外，根據報道，姜黃醇處理可增加miR-30a-5p的表達并激活Hippo信號通路，進而抑制結直腸癌細胞的侵襲和遷移[16]。本研究調查了貓眼草提取物對IL-1β誘導的結直腸癌細胞中miR-30a-5p表達的潛在影響。結果發現，貓眼草提取物增加了IL-1β誘導的結直腸癌細胞中miR-30a-5p的表達。而anti-miR-30a-5p可以逆轉貓眼草提取物對IL-1β誘導的結直腸癌細胞HT29增殖、遷移、侵襲的影響。提示貓眼草提取物抑制IL-1β誘導的結直腸癌細胞生長和轉移的功能與上調miR-30a-5p有關。

NF-κB是一種已知參與調節癌癥發展的轉錄因子，尤其是腫瘤侵襲和轉移[17]。腫瘤中NF-κB的激活驅動腫瘤細胞增殖、存活和侵襲。此外，NF-κB的激活主要是由腫瘤微環境中的炎性細胞因子(如IL-1、TNF-α等)驅動的。根據報道，IL-1β/NF-κB信號通過miR-181a/PTEN軸促進結直腸癌細胞生長[18]。可見IL-1β能激活NF-κB通路，與本研究中IL-1β提高p-p65蛋白表達水平一致，但貓眼草提取物拮抗這種作用。此外，anti-miR-30a-5p逆轉了貓眼草提取物對p-p65蛋白表達的抑制作用。可見，貓眼草提取物通過上調miR-30a-5p并抑制NF-κB信號通路活性來抑制IL-1β誘導的結直腸癌細胞生長和轉移。

總之，這些結果表明貓眼草提取物通過上調miR-30a-5p、下調NF-κB信號通路活性，來抑制IL-1β誘導的結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲。這些發現提供了對貓眼草提取物在抑制結直腸癌生長中作為炎癥反應調節劑的中心功能的新理解，為貓眼草應用于結直腸癌治療提供了基礎。