補陽還五湯對腦缺血/再灌注損傷大鼠皮質區沉默信息調節因子1表達的影響

辛紫媛，靳曉飛，周曉紅，趙艷萌，劉真一，張彐寧，高維娟，

(1. 承德醫學院病理生理學教研室，河北 承德 067000；2.河北中醫學院 河北省心腦血管病中醫藥防治研究重點實驗室，河北 石家莊 050091)

補陽還五湯是治療缺血性腦卒中氣虛瘀證的代表方劑，最早記載于清朝王清任著《醫林改錯·下卷·癱痿論》中，臨床療效確切，但其具體機制尚未明確[1]。腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia/reperfusion injury,CIRI)是缺血性腦卒中的重要病理過程，直接影響該病的預后和轉歸，其發生機制蘊含著缺血性腦卒中的潛在治療靶點。沉默信息調節因子1(silent information regulation 1，SIRT1)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)依賴性Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶，通過去乙酰化組蛋白和一些非組蛋白底物參與基因調控[2]。SIRT1在神經退行性疾病和腦卒中等疾病中發揮著重要的調節作用[3]。本研究旨在探討補陽還五湯對CIRI大鼠發揮保護作用時是否通過調節皮質區SIRT1蛋白，以期進一步挖掘補陽還五湯治療CIRI的作用機制，為臨床治療缺血性腦卒中提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供的7～8周齡健康♂ SPF級SD大鼠，體質量(250～280) g，許可證號：SCXK(京)2016-0011，所有動物實驗嚴格依據中國實驗動物制度倫理審查委員會關于《實驗動物管理條例》的指導方針，于河北中醫學院動物中心適應性喂養1周后進行實驗。

1.2 實驗藥物補陽還五湯購自北京同仁堂藥店，其中包括黃芪120 g、當歸6 g、赤芍5 g、紅花3 g、地龍3 g、桃仁3 g、川芎3 g，水煎濃縮至100 mL，于4 ℃冰箱儲存備用，每1 mL水煎液中含生藥量約為1.43 g。阿托伐他汀購自美國輝瑞制藥有限公司，國藥準字H20051408。

1.3 主要試劑TTC 染液(G1017)、兔抗β-actin抗體(GB11001)、尼氏染液(G1036)均購自武漢塞維爾生物科技有限公司；兔抗SIRT1抗體(#9475)購自Cell Signaling Technology公司；鼠抗SIRT1抗體(60303)購自Proteintech公司；辣根酶標記山羊抗兔IgG (ZB-2301)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；蛋白酶抑制劑(P8340)購自Sigma公司；QuickBlockTM免疫染色封閉液(P0260)、含DAPI抗熒光淬滅封片液(P0131)購自碧云天生物；CY3-羊抗小鼠IgG抗體(BA1031)購自武漢博士德。

1.4 主要儀器MCAO 栓線(北京西濃科技有限公司)、腦切片模具(北京西濃科技有限公司)；組織包埋機(Leica)、輪轉切片機(Leica)、冰凍切片機(Leica)、顯微拍照系統(Leica)；蛋白質電泳及轉膜儀(Bio-Rad)；Varioskan LUX 多功能酶標儀(Thermo)；FUSION FX5 Spectra多功能成像系統(Vilber)；PeriCam PSI激光散斑血流監測視頻系統(Perimed)。

1.5 動物模型的建立與實驗分組給藥健康 SD ♂ 大鼠，參照文獻[4]建立模型。模型組(MCAO/R)大鼠大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型缺血2 h后，再灌注72 h；補陽還五湯組(BYHWT)和陽性對照藥阿托伐他汀組(Atorvastatin)于造模后，根據人鼠等效劑量換算給予大鼠劑量為補陽還五湯14.3 g·kg-1·d-1，阿托伐他汀10 mg·kg-1·d-1，術后等待大鼠完全清醒后立即灌胃給藥，每24 h給藥1次，共3次。

1.6 腦血流監測用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，剪開顱頂皮膚暴露前囟，均勻的將腦膜薄化，固定好探頭，在該區域不時滴加生理鹽水保持腦膜濕潤。應用PeriCam PSI 激光散斑血流監測視頻系統動態監測大鼠缺血前、缺血中、缺血/再灌注后局部腦血流量變化，選取感興趣區域(region of interest，ROI)，以ROI值代表相應區域內微循環血流灌注量，計算缺血側局部腦血流量占基線水平的百分比。

1.7 神經功能學評分缺血2 h/再灌注72 h后，根據 Zea Longa 5分制評分標準，采用盲法觀察大鼠神經功能學評分并記錄。評分標準為：0分，無神經功能缺損的癥狀；1分，提尾時不能伸展對側前爪并內旋；2分，爬行時向對側轉圈；3分，爬行時向對側傾倒；4分，不能行走或意識喪失。

1.8TTC染色測定腦梗死體積大鼠麻醉后迅速斷頭取出完整腦組織，-20 ℃冰箱中冷凍30 min，腦切片模具中制備2 mm的連續冠狀腦片，在TTC溶液中37 ℃避光浸染30 min，染色完成后放入10%中性福爾馬林固定液中固定24 h，腦組織連續冠狀切片按自后向前的順序擺放拍照，ImageJ軟件測定腦片白色缺血梗死區體積和紅色正常組織體積，計算梗死體積百分率。

1.9 尼氏染色觀察皮質區神經細胞形態厚度5 μm石蠟切片脫蠟至水，經尼氏染液染色2～5 min流水水洗，0.1 %的冰醋酸分化，脫水透明，稍干燥中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照，觀察神經細胞形態，應用ImageJ軟件計算神經細胞數量。

1.10 Western blot檢測皮質區SIRT1蛋白表達約60 μg提取總蛋白，按1 ∶10加入組織裂解液低溫勻漿，取上清液BCA法進行蛋白定量；按4 ∶1加入5×loading buffer后100 ℃金屬浴10 min使蛋白變性；蛋白上樣進行SDS-PAGE 凝膠電泳，并轉移到PVDF膜上；室溫下在5%脫脂奶粉中封閉2 h，TBST洗膜后；滴加一抗SIRT1抗體(1 ∶1 000)及內參抗β-actin(1 ∶2 000)抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后；加入二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜后；ECL液顯色，使用VisionCapt軟件獲取圖像并分析，以β-actin為內參照蛋白，通過分析目的蛋白與內參照蛋白的灰度比值，得出目的蛋白的相對表達水平。

1.11 免疫熒光染色檢測皮質區SIRT1熒光表達厚度8 μm的冰凍切片用快速封閉液封閉15 min，滴加抗SIRT1抗體(1 ∶500) 4 ℃孵育過夜，TBST洗片；滴加CY3-羊抗小鼠IgG抗體(1 ∶100)，室溫避光孵育1 h，TBST洗片；滴加含DAPI抗熒光淬滅劑封片后，避光保存并在熒光顯微鏡下觀察拍照，觀察SIRT1蛋白表達位置以及熒光表達強度。

2 結果

2.1 腦血流量評價模型建立成功大鼠缺血前腦血流ROI值為基線值，插入線栓阻塞后ROI值呈現明顯的下降趨勢且降幅達到基線65%以上，恢復血液再灌注后ROI值明顯的上升趨勢超過80%以上，證明造模成功(Fig 1)。

2.2 各組大鼠神經功能缺損的變化神經功能學評分顯示，與Sham組相比，MCAO/R組大鼠神經功能缺損程度嚴重，神經功能評分明顯升高(P<0.05)；與MCAO/R組相比，BYHWT組和Atorvastatin組大鼠神經功能缺損程度減輕，評分明顯降低(P<0.05)(Fig 2)。

Fig 1 Cerebral blood flow monitoring

Fig 2 Neurological deficit score of rats in each group n=9)

2.3 各組大鼠腦梗死體積變化TTC染色顯示，與Sham組相比，MCAO/R組左側大鼠腦組織出現明顯白色梗死灶(P<0.05)；與MCAO/R組相比，BYHWT組和Atorvastatin組大鼠腦梗死體積明顯減小(P<0.05)(Fig 3)。

2.4 各組大鼠皮質區神經細胞損傷的變化尼氏染色顯示，Sham組大鼠神經細胞排列整齊、緊密，胞核清晰，尼氏體大、呈深藍色，神經細胞數量豐富。與Sham組相比，MCAO/R組細胞損傷嚴重、排列不規整，細胞核碎裂、溶解呈空泡狀，尼氏體顏色變淺、解體甚至消失，部分神經細胞丟失、數量明顯減少(P<0.05)；與MCAO/R組相比，BYHWT組和Atorvastatin組細胞損傷均有所改善、形態較完整、排列較整齊，尼氏體又重新出現，完整神經細胞數量增多(P<0.05)(Fig 4)。

2.5 各組大鼠皮質區 SIRT1 蛋白表達的變化Western blot檢測顯示，與Sham組相比，MCAO/R組SIRT1蛋白表達下降(P<0.05)；與MCAO/R組相比，BYHWT組和Atorvastatin組可明顯提升SIRT1蛋白表達強度(P<0.05)(Fig 5)。

2.6 各組大鼠皮質區 SIRT1 熒光表達的變化免疫熒光檢測顯示，細胞核為藍色熒光標記，SIRT1為紅色熒光標記，藍色熒光與紅色熒光部分重合，紅色熒光也可在藍色熒光周圍顯示，提示SIRT1在缺血側腦組織細胞核和細胞質中均有表達。缺血2 h/再灌注72 h后，與Sham組相比，MCAO/R組紅色熒光減少提示 SIRT1 表達下降，BYHWT和Atorvastatin組紅色熒光增強，提示可提升SIRT1表達(Fig 6)。

Fig 3 Cerebral infarction volume of rats in each group n=3)

3 討論

腦卒中是嚴重威脅人類生命健康的常見疾病之一，主要是由于高血壓、吸煙、糖尿病、血脂異常、不良飲食、缺乏運動和肥胖等不良因素誘發，大約80%的腦卒中與缺血性腦卒中有關[5]。缺血性腦卒中可導致嚴重的腦功能障礙，具有較高的發病率、致殘率、復發率和死亡率，嚴重影響患者的生活質量[6]。臨床上主要通過溶栓和栓子切除術快速重建血液循環，成功地恢復血液灌注后進一步加重損傷，導致 CIRI[7]。 CIRI 涉及一系列復雜的病理生理過程，現代醫學研究發現能量衰竭、興奮性氨基酸毒性、神經炎癥、神經細胞凋亡和氧化應激等多個環節參與該進程[8]。治療急性缺血性腦卒中的關鍵是拯救圍繞在缺血性核心梗死區周圍的皮質缺血半暗帶缺血腦組織，該區域沒有遭受不可逆損傷且可以恢復[9]。探索CIRI的致病機理和作用靶點對腦卒中的發生、發展以及預后都發揮著重要的作用。

Fig 4 Morphological changes of cortical nerve cells in each group n=3)

Fig 5 SIRT1 protein expression in cortical area of rats in each group n=3)

翻譯后修飾在基因表達調控中發揮重要作用，sirtuins是NAD+依賴性蛋白脫乙酰酶，隨著近年來對組蛋白基因修飾的深入研究，已經證明了組蛋白去乙酰化與神經系統疾病密切相關[10]。1999年SIRT1在人類中被首次發現，是sirtuins蛋白家族中第一個被發現的成員，位于染色體10 q，在人類細菌中高度保守[11]。可定位于細胞核和細胞質，在細胞質中它促進了細胞核與細胞質的穿梭，通過多種信號和生存途徑參與機體調控[12]。腦組織缺血缺氧后，SIRT1作為能量調節的樞紐，利用輔酶NAD+去乙酰化靶蛋白，不僅在調節神經細胞能量代謝方面發揮重要作用，而且在抗氧化應激、減輕炎癥、抗細胞凋亡等方面也發揮著減輕腦組織缺血后再灌注損傷的作用[13]。

腦卒中在中醫被稱之為中風，《內經》謂其“風性善行而數變”，以吐沫身直、口噤筋急、舌強而不能言、手足不遂為主要病證，起病之急、發展之迅速[14]。經典名方補陽還五湯主治證為氣虛血滯，脈絡瘀阻所致中風，7種單味藥黃芪、當歸、赤芍、地龍、川芎、紅花和桃仁諸藥合用，共奏補氣活血通絡之功效，全方具有氣旺則血行，活血不傷正的配伍特點[15]。已有研究表明，通過建立腦微血管內皮細胞氧糖剝奪再灌注損傷模型，發現補陽還五湯含藥血清對腦微血管內皮細胞氧糖剝奪再灌注誘導的氧化應激損傷的保護作用可能是通過調節SIRT1實現的[16]。補陽還五湯含藥血清可上調SIRT1表達，下調基質金屬蛋白酶2表達，進而防止人血管平滑肌細胞的年齡相關遷移和侵襲[17]。補陽還五湯可靶向調節海馬區SIRT1 / VEGF通路促進CIRI后血管新生[18]。

本研究建立MCAO大鼠模型缺血2 h/再灌注72 h，我們觀察到大鼠出現大面積腦梗死，伴隨明顯的皮質神經細胞損傷，經補陽還五湯治療后組織損傷明顯改善，觀察到皮質SIRT1蛋白的表達明顯升高，提示補陽還五湯可能通過激活皮質區SIRT1靶點進而發揮保護作用，其中補陽還五湯在CIRI中調節SIRT1的具體作用機制是我們課題組進一步探討的方向。

Fig 6 SIRT1 fluorescence in cortical area of rats in each group (IF,×400)

Blue represented DAPI positive signal; red represented SIRT1 positive signal.