奇蘭秋季紅茶加工過程主要生化成分變化及相關酶基因表達

劉金仙, 盧 莉, 傅仙玉, 史凌珊, 武廣珩

奇蘭秋季紅茶加工過程主要生化成分變化及相關酶基因表達

劉金仙1,2, 盧 莉1,2, 傅仙玉1,2, 史凌珊1,2, 武廣珩3*

1. 武夷學院茶與食品學院，福建武夷山 354300；2. 中國烏龍茶產業協同創新中心，福建武夷山 354300；3. 福建省生態產業綠色技術重點實驗室，福建武夷山 354300

以武夷名叢奇蘭秋季鮮葉為原料，按傳統紅茶加工工藝制成紅茶，并探明其加工過程中主要生化成分含量、多酚氧化酶（PPO）活性及相關酶基因表達的變化規律，以期為秋季紅茶品質改良和工藝改進提供一定參考。結果表明：從鮮葉（XY）至發酵結束（FJ8），茶多酚、兒茶素、水浸出物、咖啡堿分別下降6.13%、15.66%、10.64%、0.10%；黃酮、茶黃素、茶紅素、茶褐素、游離氨基酸分別上升4.98 mg/g、7.45 mg/g、2.03%、5.58%、0.14%，其中咖啡堿變化幅度最小。茶黃素、茶紅素、茶褐素與兒茶素呈極顯著負相關，相關系數分別為：-0.991、-0.969、-0.972。PPO活性呈波動變化，萎凋階段先上升后下降，揉捻時達到峰值，為458.83 U/g，約為XY的1.67倍；發酵階段快速下降，FJ8時，PPO酶活顯著低于XY，約為XY的0.89。多酚氧化酶基因、表達變化規律一致：先上升后下降，相對表達量在萎凋15 h（WD15）最高，分別為XY的11.2、12.8倍，揉捻時開始下降，發酵階段表達量與鮮葉無顯著差異。兒茶素類代謝相關酶基因、、、、、￠￠、、、、的表達在加工過程中均受不同程度抑制，相對表達量顯著低于XY，除與CG（兒茶素沒食子酸酯）呈負相關外，與兒茶素其他組分均呈正相關，但不顯著，相關系數在0.130～0.750之間。

秋季鮮葉；紅茶加工；生化成分；多酚氧化酶；相關酶基因

我國夏秋季雨水足、光照強、溫度高，茶樹生長快，鮮葉產量高，每年產量可占全年鮮葉總產量的60%[1]。但夏秋茶受季節的影響，葉片中多酚類物質含量較高，氨基酸、芳香類物質等含量相對較低，用其加工烏龍茶或綠茶，苦澀感強、綜合品質差、市場接受度低[2-3]。而茶多酚類物質是形成紅茶茶湯紅艷明亮，滋味濃、強、鮮爽的重要物質基礎[4]，因為紅茶屬于全發酵茶，在其加工過程中，多酚類物質會在多酚氧化酶和過氧化物酶的作用下生成茶黃素和茶紅素[3]。茶黃素具有辛辣和強烈收斂性，對紅茶滋味有極為重要的作用，影響著紅茶茶湯的濃度、強度和鮮爽度，尤其是強度和鮮爽度，茶紅素色澤棕紅，是紅茶湯色“紅”的主要成分，也是湯味濃度和強度的重要物質[5-6]。為此在利用夏、秋季鮮葉加工紅茶方面，前人展開了大量研究[7-9]，但大都集中于不同加工工藝對品質影響，對鮮葉中主要化學成分在加工中變化缺乏系統性、整體性研究，特別跟品質相關的酶活變化及關鍵酶基因的表達變化研究更是甚少。因此，本研究以武夷名叢奇蘭秋季鮮葉為原料，按傳統紅茶加工工藝對其進行加工，并在各工藝點取樣，檢測其加工過程中主要生化成分、多酚氧化酶酶活、兒茶素類物質代謝相關酶基因表達的動態變化，通過數據整合分析，探討主要化學成分變化規律及相關酶基因表達規律，研究結果可為秋季紅茶品質改良和工藝改進提供一定參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試品種為奇蘭，種植于武夷學院茶樹種質資源圃，采摘標準為一芽二葉，采摘、加工制作、取樣時間為2021年9月。

1.2 方法

1.2.1 紅茶樣品制備與取樣 采摘的鮮葉按傳統紅茶制作工藝加工，并在鮮葉（XY）、萎凋5 h （WD5）、萎凋10 h（WD10）、萎凋15 h（WD15）、揉捻（RN）、發酵4 h（FJ4）、發酵8 h（FJ8）等工藝點取樣，理化檢測所取樣品采用烘干固樣，兒茶素、多酚氧化酶檢測及基因表達定量分析所取樣品采用液氮固樣，固樣后置于-80℃冰箱保存備用。

1.2.2 樣品生化成分測定 磨碎茶樣的制備參照國標（GB/T 8303—2002）[10]；茶多酚總量測定參照國標《茶茶多酚測定》（GB/T 8313—2008）福林酚法[11]；游離氨基酸含量測定參照國標《茶游離氨基酸的測定》（GB/T 8314—2002）[12]；水浸出物含量測定參照國標《茶水浸出物測定》（GB/T 8305—2002）[13]；咖啡堿測定參照國標《茶咖啡堿測定》（GB/T 8312—2002）[14]；黃酮含量測定采用三氯化鋁比色法[15]；茶紅素、茶褐素測定參照分光光度法[16]；兒茶素、茶黃素測定采用高效液相色譜法測定，色譜條件為Agilent EC-C18，流動相A：90 mL乙腈、20 mL乙酸、2 mL EDTA定容至1 L，過0.45 μm濾膜；流動相B：800 mL乙腈、20 mL乙酸2 mL EDTA定容至1 L，過0.45 μm濾膜；柱溫40℃；進樣量10 μL；流速0.8 mL/min；梯度如下：100%A—15 min 68%A，32%B—25 min 68%A，32%B—30 min 100%A；檢測波長278 nm。所有生化成分均重復測定3次。

1.2.3 多酚氧化酶測定 多酚氧化酶測定采用多酚氧化酶檢測試劑盒（Solarbio），具體操作按試劑盒說明書進行。

1.2.4 加工過程相關酶基因表達分析

（1）RNA提取及cDNA合成。使用多糖多酚植物RNA提取試劑盒（TIANGEN）提取樣品總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的完整性，cDNA合成采用Go ScriptTMReverse Transcription Mix (Promega)逆轉錄試劑盒，具體使用步驟見說明書。

（2）熒光定量PCR分析。以茶樹18S為內參，檢測加工過程主要相關酶基因的表達差異性，引物參照前人研究[17-19]，具體見表1。SYBR Green試劑盒為SuperReal PreMix Plus (TIANGEN)，PCR儀為CFX96實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad），以XY對照，其基因的表達量定義為1個單位，采用2–DDCT法計算基因的相對表達量，每個樣品均進行3次重復。

表1 相關酶基因熒光定量PCR引物

1.3 數據處理

數據處理及分析采用Microsoft Excel 2007、DPS 7.05、SPSS 19.0等軟件進行。

2 結果與分析

2.1 加工過程主要生化成分變化分析

2.1.1 多酚類物質變化分析 茶葉中的多酚類物質及其氧化產物有茶多酚、兒茶素、黃酮、茶黃素、茶紅素、茶褐素等。從表2可看出，隨著加工的推進，茶多酚含量呈逐步下降趨勢，總體下降差異顯著，由XY的22.36%到FJ8的16.23%，下降了6.13%，降幅達到27.42%。

兒茶素類物質是茶葉澀味品質的主要呈味物質，約占茶多酚總量的70%[20]。在奇蘭秋季紅茶加工過程中共檢測到8種兒茶素單體（表2）。從表2可知，總體含量排序為EGCG（表沒食子兒茶素沒食子酸酯）>EGC（表沒食子兒茶素）>ECG（表兒茶素沒食子酸酯）>EC（表兒茶素）>GC（沒食子兒茶素）>C（兒茶素）>GCG（沒食子兒茶素沒食子酸酯）>CG（兒茶素沒食子酸酯）。由于各兒茶素單體參與眾多反應，加工過程中不斷變化，除CG呈波動上升之外，其余總體呈波動下降趨勢，其中EGCG、EC、EGC、ECG與兒茶素總量變化趨勢相似，萎凋階段先是緩慢上升，但上升差異不顯著，萎凋后期開始下降；另外，下降單體中除C外，其余均是在RN時出現急劇下降，發酵階段持續下降，這與劉亞芹等[21]、方駿婷[22]等的研究結論相似；從工序XY到RN，GC、EGCG、EC、GCG、EGC、ECG、酯型兒茶素、非酯型兒茶素及兒茶素總量降幅分別達到65.40%、51.96%、20.16%、33.61%、66.38%、21.70%、46.54%、55.65%、49.04%，至工序FJ8時，降幅分別為98.41%、92.75%、91.88%、92.62%、93.62%、83.49%、90.51%、93.82%、91.42%，非酯型兒茶素總體下降幅度大于酯型兒茶素。

黃酮是一類低分子量的多酚化合物，除了與紅茶的品質密切相關之外，還具有抗氧化、抗炎癥、抗動脈硬化等保健功效[23]。加工過程中黃酮的變化趨勢與茶多酚相反，總體呈不斷上升趨勢，FJ8工序時，黃酮含量達10.45 mg/g，約為XY工序時的1.9倍，這與薄佳慧等[23]研究得出的黃酮在金花白茶加工過程總體呈上升變化的結論相近，與方駿婷[22]、張亞楠[2]等研究紅茶加工過程黃酮總體是下降的結論相反，具體原因有待進一步探究。

表2 奇蘭秋季紅茶加工過程多酚類物質的動態變化

注：同列數據后不同小寫字母表示處理間差異顯著（<0.05）。

Note: Different lowercase letters after the same column of data indicate significant difference (<0.05).

茶黃素（theaflavins, TFs）、茶紅素（thearubigins, TRs）及茶褐素（theabrownins, TBs）都是茶多酚的水溶性氧化產物，直接影響紅茶品質。其中TFs是影響茶湯亮度、滋味強度和鮮度的重要成分，由茶黃素雙沒食子酸酯（TFDG）、茶黃素-3￠-沒食子酸酯（TF-3￠-G），茶黃素（TF）、茶黃素-3-沒食子酸酯（TF-3-G）組成。從表3可知，TFDG、TF-3￠-G在鮮葉和萎凋階段并未檢測出，而TF、TF-3-G有檢測出，含量雖低，但總體呈緩慢上升趨勢；RN時TFDG、TF-3￠-G均已檢測出，含量分別為1.33 mg/g、0.35 TF mg/g，TF、TF-3-G含量開始出現急劇上升；進入發酵后4種單體含量持續上升，其中TFDG、TF-3￠-G及TF在FJ4時達到峰值，分別為2.97 mg/g、0.81 mg/g，1.22 mg/g，TF-3-G峰值出現在FJ8，為4.05 mg/g；茶黃素總量變化規律與TF、TF-3-G相似，先緩慢上升后急劇上升，FJ4時茶黃素總量為9.03 mg/g，FJ8時有所下降，但仍為XY的9.37倍，可見茶黃素主要是在加工中后期形成。

表3 奇蘭秋季紅茶加工過程茶黃素組分動態變化

注：ND表示未檢測出；同列數據后不同小寫字母表示處理間差異顯著（<0.05）。

Note: ND indicates no detection; Different lowercase letters after the same column of data indicate significant difference (<0.05).

TRs是構成茶湯“紅”的主體物質，對茶湯滋味與湯色濃度起主要作用，TBs是造成茶湯色澤“深”的主要因素。加工過程TRs、TBs的含量變化差異顯著（圖1），TRs變化規律是先上升后下降，在FJ4時含量達到高峰，為5.56%，約為XY的1.73倍；TBs總體呈不斷上升趨勢，特別是發酵階段，總體含量要高于TRs，FJ8時含量達7.67%，約為XY的3.78倍，比TRs高出2.43%。相關性分析得知，TFs、TRs、TBs與兒茶素呈極顯著負相關（<0.001），相關系數分別為–0.991、–0.969、–0.972，說明兒茶素的下降與茶三素的形成高度相關。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

2.1.2 水浸出物、咖啡堿及游離氨基酸的變化 水浸出物是茶葉中可溶于水的各種物質的總稱，與茶湯滋味的濃強度有關。從圖2可看出，加工過程中水浸出物含量先上升后下降，WD15時達最高值，為48.64%，與XY相比，上升了2.72%，RN時開始下降，FJ8降到最低，為35.28%，相比XY，降低了13.36%?？Х葔A味苦，但會與茶多酚及其氧化物形成具有鮮爽滋味的絡合物，也是構成茶湯滋味的重要成分。本研究加工過程咖啡堿含量雖呈“上升—下降—上升—下降”的波動變化（圖2），但總體變化幅度不大，WD15時含量最高，為2.73%，相比XY增加了0.24%，到FJ8含量最低，為2.39%，與XY相比僅降低0.10%。游離氨基酸是茶葉鮮味的主要呈味物質，同時也參與香氣的形成。圖2顯示氨基酸含量在萎凋階段不斷上升，在WD15時達到最高值4.93%，相比XY，增加了0.90%，RN時開始下降，發酵階段進一步減少，但總體含量仍比XY高，FJ8時含量為4.17%，比XY高0.14%，總體變化規律與劉亞芹等[21]、王小云等[24]研究結論較為一致。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

2.2 加工過程中PPO活性變化及CsPPO1、CsPPO2基因表達分析

多酚氧化酶（PPO）可將茶葉中的多酚類物質酶促氧化成茶黃素、茶紅素等，直接影響紅茶品質，在紅茶加工中至關重要。奇蘭秋季紅茶加工過程PPO酶活總體呈“M”型波動變化（圖3A），與李會娟[25]研究紅茶加工過程中PPO活性變化規律較為相似。從工序XY到WD10逐步上升，WD15時有所下降，PPO酶活為319.53 U/g，揉捻時達到峰值為458.83 U/g，約為XY的1.67倍，進入發酵后逐步下降，FJ8時降至最低，為243.87 U/g，相比RN降幅達46.85%。結合前人研究分析，發酵階段PPO酶活之所以顯著下降，主要是因為從鮮葉到揉捻PPO快速增加，加速了多酚類氧化產物的快速產生，而多酚類氧化產物與酶蛋白結合形成不溶性產物，抑制了PPO酶活性[2, 26]。

利用定量PCR測定了多酚氧化酶基因、在奇蘭秋季紅茶加工過程的相對表達量，發現、在加工過程中相對表達量變化規律一致（圖3B），先上升后下降，均在WD15時出現表達高峰，相對表達量分別為XY的11.2、12.8倍，揉捻時急劇下降，發酵階段持續下降，FJ4、FJ8時、基因的相對表達量均與XY無顯著差異。另外，對比圖3A與圖3B發現，PPO酶活變化規律與多酚氧化酶基因、表達變化規律并未一致，PPO酶活峰值出現時間比、基因相對表達量峰值晚，PPO酶活峰值出現在RN，而基因表達出現在WD15。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

2.3 加工過程兒茶素類物質代謝相關酶基因的表達分析

作為澀味主要呈味物質兒茶素是植物重要的次生代謝產物，其代謝途徑與其他植物類黃酮物質代謝途徑基本一致，主要有莽草酸途徑、苯丙燒代謝途徑和類黃酮合成途徑，涉及的主要酶類有[27-28]：PAL（苯丙氨酸脫氨酶，phenylalanine ammonialyase）、C4H（肉桂酸羥化酶，cinnamate4-hydroxylase）、CHS（查耳酮合成酶，chalcone synthase）、CHI（查耳酮異構酶，chalcone isomerase）、F3H（黃烷酮3-羥化酶，flavanone 3-hydroxylase）、F3￠H（黃烷酮3￠-羥化酶，flavanone 3-hydroxylase）、F3￠5￠H（黃烷酮3￠,5￠-羥化酶，flavonoid 3￠,5￠-hydroxylase）、DFR（二氫黃烷醇4-還原酶，dihydroflavonol 4-reductase）、LAR（無色花色素還原酶，leucoanthocyanidin reductase）、ANR（花青素還原酶，anthocyanidin reductase），FLS（黃酮醇合成酶，Flavonol synthase）、ANS（花青素合成酶，anthocyanidin synthase）等。眾多研究表明，植物類黃酮的生物合成積累及其相關基因的表達受到紫外線、紅光輻照、生長調節劑等外界因素，以及低溫、病原體侵染等逆境脅迫的影響[29]。茶葉加工過程中的萎凋、揉捻、發酵等本身就是一種逆境，因此，利用qRT-PCR技術探究這幾個相關基因在加工過程的表達情況，除￠、基因未檢測出外，其他結果見圖4，從圖4中可知：不同基因有不同表達變化規律，其中與基因相對表達量變化規律一致，從XY到WD10，表達量持續下降，WD15時表達有所上升，RN時又下降，雖有波動變化，但所有萎凋、揉捻、發酵環節相對表達量無顯著差異；與基因隨著加工過程推進，相對表達量呈不斷下降變化趨勢；、、、、￠￠、基因表達變化規律相似。均為下降—上升—下降，其中、、￠￠基因在WD15時相對表達量有所上升，RN時又急劇下降；DFR是在WD10有所上升，WD15又開始下降，但與WD10無顯著差異，RN時急劇下降，且與整個發酵階段無顯著差異；與則是在RN時有所上升，進入發酵后又急劇下降。綜上分析可知，所有基因在萎凋、揉捻、發酵等加工環節的表達均受不同程度抑制，表達量顯著低于鮮葉XY，除了與基因在揉捻時有所上升外，其中基因的表達均是揉捻后急劇下降，說明揉捻造成的機械損傷會強烈抑制這些基因的表達。

2.4 加工過程兒茶素組分與兒茶素類代謝相關酶基因表達量的相關性分析

運用SPSS軟件分析兒茶素組分含量與相關酶基因相對表達量的相關性（表4），從表4可知，、、、、、￠￠、、、、與CG呈負相關，相關系數為–0.539～–0.280；與GC、C、EGCG、EC、GCG、EGC、ECG、總兒茶素（TCA）呈正相關，但均不顯著，相關系數在0.130～0.750之間，其中與C的相關系數值最低，為0.130～0.394；另外基因與GC、CG、EGCG、EC、GCG、EGC、ECG、TCA相關系數絕對值最大，分別為0.750、0.539、0.714、0.616、0.671、0.737、0.624、0.709，因此推測DFR是奇蘭紅茶加工中主導兒茶素合成的主要酶類之一。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

表4 兒茶素組分與相關酶基因表達量的相關性分析

3 討論

3.1 奇蘭秋季紅茶加工過程主要生化成分變化

茶葉生化成分的含量是決定茶湯的滋味的物質基礎，而生化成分的含量與整個加工工藝密切相關。多酚類物質在加工時經過酶促氧化、非酶促氧化、熱解、聚合、轉化等反應，部分氧化成茶三素，部分多酚類及其氧化產物與蛋白結合產生不溶性化合物[30]，所以含量總體呈下降趨勢。本研究發現，除黃酮不斷上升和兒茶素單體CG波動上升之外，其余總體呈下降趨勢，其中茶多酚呈不斷下降趨勢，從XY的22.36%到FJ8的16.23%，下降了6.13%。兒茶素單體EGCG、EC、EGC、ECG與及兒茶素總量變化趨勢相似，先是緩慢上升后下降，另外下降的單體中除C外，其余均是在RN時出現急劇下降，發酵階段持續下降，從XY到RN，GC、EGCG、EC、GCG、EGC、ECG與及兒茶素總量降幅分別達到65.40%、51.96%、20.16%、33.61%、66.38%、21.70%、46.54%、55.65%、49.04%。結合前人研究分析，可能的原因是從鮮葉到萎凋水分散失，水溶性兒茶素類物質濃度增大，隨著萎凋的繼續，多酚氧化酶活性逐漸增強，兒茶素類物質開始氧化，揉捻時細胞遭破壞，兒茶素與氧化酶之間的隔離被打破，水解和氧化作用增強，因此出現急劇下降。TFs、TRs、TBs是兒茶素氧化而來，總體變化相似，呈上升趨勢，與兒茶素呈極顯著負相關，相關系數分別為-0.991、-0.969、-0.972?？Х葔A在整個加工過程雖呈波動變化，但總體變化幅度不大，FJ8含量最低，與XY相比，僅降低0.10%，這應與其穩定的化學性質有關[31]。加工過程中水浸出物與氨基酸變化規律相似，萎凋階段呈上升趨勢，均在WD15時出現峰值，含量分別為48.64%、4.93%，揉捻開始下降，到發酵階段持續下降。結合前人研究分析，可能的原因是萎凋失水細胞內水解酶活性增強，一些不溶性物質轉化為可溶性物質，如低分子蛋白質、多肽類化合物水解，所以萎凋階段水浸出物與氨基酸含量增加[32]；揉捻使細胞損傷，呼吸作用和酶促氧化作用增強，細胞內可溶性物質發生水解，所以水浸出物與氨基酸含量開始下降；發酵階段因呼吸作用和酶促氧化作用持續，導致水浸出物含量持續下降，另外，雖然蛋白質持續水解，但游離氨基酸參與脫氨、脫羧等眾多反應，形成了相應的醇、醛、酸等，導致氨基酸含量也逐步下降[21]。

3.2 加工過程PPO酶活變化及CsPPO1、CsPPO2基因表達特性

PPO以其在紅茶加工中的重要作用受到廣泛關注和研究。BOKUCHAVA[33]、竹尾忠一[34]研究發現，PPO活性在茶鮮葉的萎凋、揉捻工藝中逐漸增加，揉捻時酶活性高達鮮葉的2～3倍。阮宇成[35]在紅碎茶加工中PPO活性及同工酶的變化研究中，也得到了類似的結果。劉仲華等[36]研究發現，PPO活性隨萎凋過程中茶葉失水而提高，含水量為65%左右時活性達到頂峰，但進一步過度萎凋使PPO活性降低。TAKEO[37]研究表明，PPO活性在揉捻時急驟增加，隨后依發酵進程而降低，且發酵溫度越高，酶活性下降越快。筆者在奇蘭秋季紅茶加工過程中發現，PPO酶活呈“M”型變化趨勢，在鮮葉萎凋階段先逐步上升，萎凋后期（WD15）時下降，揉捻時急劇上升，且達到峰值，進入發酵后又持續降低，這一結果與前人研究結果較為一致，也進一步驗證了前人的研究。

PPO是由多個基因編碼，具有多基因家族特性，且家族基因較為保守。筆者在奇蘭秋季紅茶加工過程中檢測了、的相對表達量，表達量均在萎凋階段逐步上升，WD15時達到峰值，表達量分別約為XY的11.2、12.8倍，進入發酵后又逐步下降，它們表達量變化規律完全一致。李會娟[25]在“茶樹CsPRXs在干旱脅迫和紅茶加工中的表達分析”研究中也發現、表達量變化規律在加工過程中也一致[25]。推測其原因可能是家族基因保守，保守域在加工中發揮了相同的功能。

本研究結果分析發現，PPO酶活變化規律與、表達變化規律不一致，本試驗PPO酶活測定采用的是體外提取的粗酶，粗酶是含有較多同工酶的混合酶，因此，PPO酶活不一定完全由、基因調控，所以它們變化規律不一樣應屬正常。另外還發現PPO酶活峰值出現在RN，比、基因相對表達量峰值晚，推測其可能的原因是從基因開始到最后表現出PPO酶活性中間有很多過程，如基因的翻譯，蛋白質的修飾以及酶的活性表現等[38]，這些因素都有可能造成酶活性比基因表達晚的現象。

3.3 加工過程兒茶素類物質代謝相關酶基因的表達及其與兒茶素組分的相關性

從本試驗多酚類物質變化分析可知，奇蘭秋季紅茶加工過程兒茶素組分及總兒茶素不斷發生變化，除了加工過程受各氧化酶影響外，推測還可能與兒茶素生物合成途徑上調控基因有關。從前人研究可知，植物類黃酮的生物合成積累及其相關基因的表達受到外界環境、逆境脅迫等因素影響，而茶葉加工過程中的萎凋、揉捻及發酵等過程就屬于失水、機械損傷逆境。陳靜[29]在白茶萎凋過程中發現、、、F3H、、、的表達與兒茶素組分單體EC、GC、EGC的積累規律基本一致，兒茶素組分與相關酶基因表達水平的相關系數為0.22～0.99，部分為顯著相關，研究認為白茶萎凋過程中發現兒茶素合成途徑關鍵基因表達水平具有調控兒茶素生物合成的作用。而本研究發現，、、、、、￠￠、、、、基因在萎凋、揉捻、發酵等加工環節的表達均受不同程度抑制，表達量顯著低于鮮葉XY，除了與基因在揉捻時有所上升外，其余基因的相對表達均是揉捻時急劇下降，說明機械損傷對這些基因的表達具有強烈的抑制作用。另外，相關性分析發現，這些基因除了與CG呈負相關外，與GC、C、EGCG、EC、GCG、EGC、ECG、總兒茶素（TCA）均呈正相關，相關系數在0.130～0.750之間，但均不顯著。因此，在奇蘭秋季紅茶加工過程中，這些關鍵酶基因具有調控兒茶素生物合成的作用有待進一步研究。

[1] 敬廷桃, 鐘應富, 袁林穎, 周正科. 改善夏秋綠茶滋味品質研究現狀[J]. 茶葉, 2006(3): 133-135.

JING T T, ZHONG Y F, YUAN L Y, ZHOU Z K. Research status of improving taste of summer and autumn green teas[J]. Journal of Tea, 2006(3): 133-135. (in Chinese)

[2] 張亞楠. 黃金茶1號夏秋紅茶加工技術及香味品質形成機理研究[D]. 長沙: 湖南農業大學, 2019.

ZHANG Y N. Study on the processing technology and forming mechanism of aroma and taste quality of black tea of Huangjin 1 tea mading in summer and autumn[D]. Changsha: Hunan Agriculture University, 2019. (in Chinese)

[3] 王雪萍, 龔自明. 夏秋季茶樹遮陰效應研究進展[J]. 湖北農業科學, 2017, 56(23): 4447-4453.

WANG X P, GONG Z M. Research progress of shading effect of tea in summer and autumn[J]. Hubei Agriculture science, 2017, 56(23): 4447-4453. (in Chinese)

[4] 蕭偉祥, 鐘 瑾, 蕭 慧, 蔣顯猷. 茶紅色素形成機理和制取[J]. 茶葉科學, 1997, 17(1): 1-5.

XIAO W X, ZHONG J, XIAO H, JIANG X Y. Forming mechanism and preparation of tea red pigment[J]. Tea Science, 1997, 17(1): 1-5. (in Chinese)

[5] 丁 勇, 徐奕鼎, 王燁軍, 張必樺, 蘇有健. 祁門紅茶初制中萎凋與初烘工藝研究[J]. 中國農學通報, 2010, 26(9): 110-114.

DING Y, XU Y D, WANG Y J, ZHANG B H, SU Y J. Study on withering and first drying technology at primary processing of Keemun black tea[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2010, 26(9): 110-114. (in Chinese)

[6] 陳昌輝, 杜 曉, 齊桂年. 工夫紅茶主要內含成分與品質的相關性分析[J]. 食品科技, 2011, 36(9): 83-87

CHEN C H, DU X, QI G N. The relativity analysis between the main components of congou black tea and its quality[J]. Food Science and Technology, 2011, 36(9): 83-87. (in Chinese)

[7] 雷攀登, 周漢琛, 吳 瓊, 張穎彬, 胡善國, 徐亦鼎, 丁 勇, 黃建琴. 做青工藝對夏季祁門紅茶品質形成影響[J]. 食品工業科技, 2017(8): 108-112.

LEI P D, ZHOU H C, WU Q, ZHANG Y B, HU S G, XU Y D, DING Y, HUANG J Q. Effect of green-making technique on the quality of summer Keemun black tea[J]. Science and Technology of Food Industry, 2017(8): 108-112. (in Chinese)

[8] 朱琳琳. 夏秋紅茶新工藝研究[D]. 武漢: 華中農業大學, 2015.

ZHU L L. Study on the new technology of summer and fall black tea[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2015. (in Chinese)

[9] 劉淑娟, 鐘興剛, 粟本文, 李 彥, 譚正初. 引進曬青、搖青工藝降低夏秋紅茶苦澀味的研究[J]. 江西農業學報, 2014, 26(6): 102-105.

LIU S J, ZHONG X G, SU B W, LI Y, TAN Z C. Study on reducing bitter and astringency taste of black tea made in autumn by introducing sunning and greed-leaf-rocking technologies[J]. Acta Agriculture Jiangxi, 2014, 26(6): 102-105. (in Chinese)

[10] 中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院. 茶磨碎試樣的制備及其干物質含量測定: GB/T 8303—2002[S]. 北京: 中國標準出版社, 2002.

Hangzhou Tea Research Institute, China COOP. Tea- preparation of ground sample and determination of dry matter content: GB/T 8303—2002[S]. Beijing: China Standards Press, 2002. (in Chinese)

[11] 中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院. 茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法: GB/T 8313—2008[S]. 北京: 中國標準出版社, 2008.

Hangzhou Tea Research Institute, China COOP. Determination of total polyphenols of catechins content in tea: GB/T 8313—2008[S]. Beijing: China Standards Press, 2008. (in Chinese)

[12] 中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院. 茶游離氨基酸總量的測定: GB/T 8314—2002[S]. 北京: 中國標準出版社, 2002.

Hangzhou Tea Research Institute, China COOP. Tea- determination of free amino acids content: GB/T 8314—2002[S]. Beijing: China Standards Press, 2002. (in Chinese)

[13] 中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院. 茶水浸出物測定: GB/T 8305—2002[S]. 北京: 中國標準出版社, 2002.

Hangzhou Tea Research Institute, China COOP. Tea- determination of water extracts content: GB/T 8305— 2002[S]. Beijing: China Standards Press, 2002. (in Chinese)

[14] 中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院. 茶咖啡堿測定: GB/T 8312—2002[S]. 北京: 中國標準出版社, 2002.

Hangzhou Tea Research Institute, China COOP. Tea- determination of caffeine content: GB/T 8312 — 2002[S]. Beijing: China Standards Press, 2002. (in Chinese)

[15] 黃意歡, 葉銀芳. 茶學實驗技術[M]. 北京: 中國農業出版社, 1997: 111-113.

HUANG Y H, YE Y F. Experimental technology of tea[M]. Beijing: China Agricultural Press, 1997: 111-113. (in Chinese)

[16] 張正竹. 茶葉生物化學實驗教程[M]. 北京: 中國農業出版社, 2009: 52-54.

ZHANG Z Z. Experimental course of tea biochemistry[M]. Beijing: China Agricultural Press, 2009: 52-54. (in Chinese)

[17] 黃 晨. 茶樹多酚氧化酶基因的克隆及其對脅迫的響應[D]. 南京: 南京農業大學, 2018.

HUANG C. Clonging of polyphenol oxidase from tea plant () and its response to stress[D]. Nanjing: Nanjing Agriculture University, 2018. (in Chinese)

[18] 馬青平. 基于多組學分析的茶樹白化機制研究[D]. 南京: 南京農業大學, 2019.

MA Q P. Albino mechanism of tea plant based on multi- omics analysis[D]. Nanjing: Nanjing Agriculture University, 2019. (in Chinese)

[19] 武廣珩, 謝其婷, 呂 橄, 林志鑾, 王飛權, 任宇紅, 張傳海. 武夷巖茶香氣相關酶基因表達差異分析[J]. 石河子大學學報(自然科學版), 2019, 37(6): 747-751.

WU G H, XIE Q T, LYU G, LIN Z L, WANG F Q, ＲEN Y H, ZHANG C H. Differential analysis of aroma-related enzyme gene expression in Wuyi rock tea[J]. Journal of Shihezi University (Natural Science), 2019, 37(6): 747-751. (in Chinese)

[20] HO C T, LIN J K, SHAHIDI F. Tea and tea products: chemistry and health-promoting properties[M]. Florida: CRC Press, 2008.

[21] 劉亞芹, 周漢琛, 王 輝, 胡善國, 黃建琴, 雷攀登, 李明智, 李詩涵. 紅茶加工過程中纖維素酶和主要品質成分的動態變化[J]. 食品工業科技, 2020, 41(6): 66-70.

LIU Y Q, ZHOU H C, WANG H, HU S G, HUANG J Q, LEI P D, LI M Z, LI S H. Dynamic changes of cellulase and main quality components in processing of black tea[J]. Science and Technology of Food Industry, 2020, 41(6): 66-70. (in Chinese)

[22] 方駿婷. 祁門紅茶加工過程中主化學成分分析[D]. 合肥: 安徽農業大學, 2016.

FAN J T. Analysis on metabolic chemical composition of Keemun black tea in processing[D]. Hefei: Anhui Agriculture University, 2016. (in Chinese)

[23] 薄佳慧, 宮連瑾, 葉興妹, 呂智棟, 李 謹, 駱偉明, 黎 娜, 肖力爭. 金花白茶加工過程中主要滋味物質的動態變化[J]. 現代食品科技, 2022, 38(1): 1-10.

BO J H, GONG L J, YE X M, LYU Z D, LI J, LUO W M, LI N, XIAO L Z. Dynamic changes of main quality components in Jinhua white tea processing[J]. Modern Food Science and Technology, 2022, 38(1): 1-10. (in Chinese)

[24] 王小云, 譚少波. 廣西六垌野生工夫紅茶加工過程中生化成分及香氣成分變化趨勢分析[J]. 南方農業學報, 2017, 48(4) :710-715.

WANG X Y, TAN S B. Biochemical components and aroma components variation of Liudong wild Kungfu black tea in Guangxi during processing[J]. Journal of Southern Agriculture, 2017, 48(4): 710-715. (in Chinese)

[25] 李會娟. 茶樹在干旱脅迫和紅茶加工中的表達分析[D]. 南京: 南京農業大學, 2019.

LI H J. The expression analysis of CsPRXs () in drought stress and black tea processing[D]. Nanjing: Nanjing Agriculture University, 2019. (in Chinese)

[26] 鄒 純, 尹軍峰. 多酚氧化酶的性質及其在茶葉加工中的研究進展[J]. 中國茶葉, 2021, 43(6): 1-6.

ZOU C, YIN J F. The properties of polyphenol oxidase and its research progress in tea processing[J].China Tea, 2021, 43(6): 1-6. (in Chinese)

[27] 劉 敏. 茶主要澀味物質代謝相關基因的差異表達分析[D]. 揚州: 揚州大學, 2015.

LIU M. Changes in the expression of genes related to the biosynthesis of catechins in tea plants ()[D]. Yangzhou: Yangzhou University, 2015. (in Chinese)

[28] 單 育. 茶樹酚類物質的生物合成及關聯合成酶基因的差異表達[D]. 合肥: 安徽農業大學, 2011.

SHAN Y. Differential expression of relative genes in tea plant [(L.)][D]. Hefei: Anhui Agriculture University, 2011. (in Chinese)

[29] 陳 靜. 白茶萎凋過程差異基因的分離與兒茶素類物質代謝關鍵酶基因的表達分析[D]. 福州: 福建農林大學, 2017.

CHEN J. Isolation of differentially expressed genes in processing of withering and expression analysis of genes encoding key enzymes in pathways of carechins metabolism in white tea[D]. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2017. (in Chinese)

[30] 何加興, 歐伊伶, 宋加艷, 肖力爭. 黃金茶1號夏秋烏龍茶加工過程化學成分變化與品質形成分析[J]. 食品工業科技, 2020, 41(18): 223-230.

HE J X, OU Y L, SONG J Y, XIAO L Z. Analysis of chemical components changes and quality formation of Huangjincha 1 summer Oolong tea during processing[J]. Science and Technology of Food Industry, 2020, 41(18): 223-230. (in Chinese)

[31] 宛晚春. 茶葉生物化學[M]. 北京: 中國農業出版社, 2003: 451.

WAN X C. Tea biochemistry[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2003: 451. (in Chinese)

[32] 廖 珺. 攤放(萎凋) 技術對茶鮮葉游離氨基酸影響的研究進展[J]. 氨基酸和生物資源, 2016(4): 15-19.

LIAO J. Research progress of the influence of spreading or withering technology on free amino acids of fresh tea leaves[J]. Amino Acids & Biotic Resources, 2016, 38(4): 15-19. (in Chinese)

[33] BOKUCHAVA M A. 制茶工藝學與生物化學[M]. 杭州: 中國農業科學院茶葉研究所情報資料研究室, 1982: 73-78.

BOKUCHAVA M A. Tea making technology and biochemistry[M]. Hangzhou: Information Research Office of Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, 1982: 73-78. (in Chinese)

[34] 竹尾忠一. 紅茶制造中多酚氧化酶活性變化研究[M]. 長沙: 湖南農學院科技情報資料室, 1973(3): 99-102.

ZHU W Z Y. Changes of polyphenol oxidase activity in black tea production[M]. Changsha: Science and Technology Information Office of Hunan Agricultural University, 1973(3): 99-102. (in Chinese)

[35] 阮宇成. 紅碎茶制造過程中多酚氧化醉活性及同工酶的變化[M]. 杭州: 中國農業科學院茶葉研究所, 1981: 209-210.

RUAN Y C. Changes of oxidative intoxication activity and Isozyme of polyphenols during the manufacture of broken black tea[M]. Hangzhou: Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, 1981: 209-210. (in Chinese)

[36] 劉仲華, 黃建安. 茶葉中多酚氧化酶研究進展[J]. 茶葉科學簡報, 1988(4): 1-6.

LIU Z H, HUANG J A. Research progress of polyphenol oxidase in tea[J]. Tea Science Bulletin, 1988(4): 1-6. (in Chinese)

[37] TAKEO T. Tea leaf polyphenol oxidase: Part III. Studies on the changes of polyphenol oxidase activity during black tea manufacture[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1966, 30(6): 529-535.

[38] 趙麗萍, 陳 亮, 王新超, 姚明哲. 茶樹新梢不同葉片中β-葡萄糖苷酶和β-櫻草糖苷酶基因表達的實時定量PCR分析[J]. 茶葉科學, 2006, 26(1): 11-16.

ZHAO L P, CHEN L, WANG X C, YAO M Z. Quantitative detection of β-glucosidase and β-primeverosidase gene expressions in different leaves of tea plant () by real-time PCR analysis[J]. Journal of Tea Science, 2006, 26(1): 11-16. (in Chinese)

Changes of Main Biochemical Components and Expression of Related Enzyme Genes of Qilan Autumn Black Tea During Processing

LIU Jinxian1,2, LU Li1,2, FU Xianyu1,2, SHI Lingshan1,2, WU Guangheng3*

1. College of Tea and Food Science, Wuyi University, Wuyishan, Fujian 354300, China; 2. Collaborative Innovation Center of Chinese Oolong Tea Industry, Wuyishan, Fujian 354300, China; 3. Fujian Provincial Key Laboratory of Eco-Industrial Green Technology, Wuyishan, Fujian 354300, China

In order to provide reference for the quality improvement and process improvement of black tea in autumn, the fresh leaves of tea cultivars Qilan were processed to black tea in autumn, and the change law of content of main biochemical components, polyphenol oxidase (PPO) activity, and related enzyme gene expression was analyzed during processing process. The tea polyphenols, catechins, water extracts, and caffeine decreased from fresh leaves (XY) to the end of fermentation (FJ8) by 6.13%, 15.66%, 10.64%, and 0.10% respectively, and flavonoids, theaflavins, thearubigins, theabrownins, and free amino acids increased by 4.98 mg/g, 7.45 mg/g, 2.03%, 5.58%, and 0.14% respectively, among which the change range of caffeine was the smallest. Theaflavins, thearubigins, theabrownins and catechins showed a very significant negative correlation, and the correlation coefficient was –0.991, –0.969, –0.972 respectively. PPO enzyme activity fluctuated, increased first and then decreased in the withering stage, reached a peak value of 458.83 U/g during rolling, about 1.67 times that of XY, finally decreased rapidly in the fermentation stage, which was significantly lower than that of XY, and was about 0.89 times that of XY. The expression of polyphenol oxidase genesandboth increased first and then decreased from rolling, and the highest relative expression appeared at 15 h of withering (WD15), 11.2 and 12.8 times that of XY, respectively. There was no significant difference between theexpression in fermentation stage and fresh leaves. The expression of catechins metabolism related enzyme genes,,,,,￠￠,,,, and Awas inhibited in varying degrees during processing, and significantly lower than that of XY. Except for the negative correlation with CG (Catechin Gallate), the genes were positively correlated with other components of catechins, and the correlation coefficient was 0.130–0.750.

autumn fresh leaves; black tea processing; biochemical components; polyphenol oxidase; related enzyme genes

S571.1

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.11.023

2022-03-28；

2022-04-17

福建省科技創新平臺建設（No. 2018N2004）；福建省自然科學基金項目（No.2022J011200，No. 2020J01410）。

劉金仙（1981—），女，博士，副教授，研究方向：茶樹栽培與綜合利用。*通信作者（Corresponding author）：武廣珩（WU Guangheng），E-mail：wugh@wuyiu.edu.cn。