膀胱癌患者來源的異種移植物模型構建與應用研究進展

李楊東，范毛川，竇啟鋒

(新鄉醫學院第一附屬醫院泌尿外科，河南 衛輝 453100)

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率分別占全部新發癌癥的 3.0%和2.1%[1-2]。近年來，膀胱癌的臨床治療主要采用部分或全膀胱切除術輔以常規放化療，但該治療方案的預后較差，常伴有多種不良反應。隨著膀胱癌相關研究的不斷深入，細胞系衍生的異種移植物模型提高了人們對癌癥進展和藥物治療作用機制的認知，但此類異種移植物模型缺乏原發腫瘤的異質性。人源性異種移植物(patient-derived tumor xenograft，PDX)模型不僅保留了與原始腫瘤相似的細胞形態、結構和分子特征，還被廣泛認為是比標準細胞系更加具有生理相關性的臨床前模型[3]，能準確預測化學治療藥物的臨床反應，再現人類腫瘤的異質性，因此，學者對腫瘤研究中PDX模型的開發和應用越來越感興趣。針對PDX模型的研究有望應用于指導腫瘤患者的個性化治療，以改善患者的生存質量。本文就既往關于PDX模型構建時小鼠種類、移植部位及方式的相關研究報道進行綜述，旨在總結不同構建方式的差異，為其應用于膀胱癌治療的研究提供參考。

1 膀胱癌PDX模型的構建

1.1 構建膀胱癌PDX模型所用的移植物樣本的獲取方式制備異種移植物模型所用的患者腫瘤組織主要來源于手術切除的病理組織，在目前廣泛采用的PDX模型的構建中，其前期準備一般采用2種方法：一是將腫瘤組織切割成1～5 mm3大小不等的碎塊置于含有青霉素、鏈霉素的培養基中進行培養[4-7]，二是將腫瘤組織裂解為單個細胞懸浮液后用基質凝膠進行培養[8]。這2種方法均有效提高了異種移植的成功率。除此之外，也有研究通過細針穿刺活檢的方式獲取患者來源的腫瘤組織，用于構建PDX模型[9-10]；但與傳統的移植物提取方式相比，這種通過活檢樣本建立PDX模型的成功率較低，因此，該方式很少用于膀胱癌患者腫瘤組織的提取。

1.2 膀胱癌PDX模型構建中免疫缺陷小鼠的選擇近年來，通常選用缺乏完整免疫系統(即體內缺乏功能性T、B淋巴細胞)的小鼠來構建PDX模型，此類小鼠能夠避免異種移植的腫瘤細胞所產生的免疫反應，故而成為了癌癥研究中常用動物模型的選擇之一[11-12]。有研究證實，將患者來源的腫瘤組織植入免疫缺陷小鼠皮下而構建的PDX模型比腫瘤細胞系模型能更準確地反映原發腫瘤的生物學特性[13]。一些團隊基于免疫缺陷小鼠的特殊性，成功構建了包括非小細胞肺癌、胃癌、卵巢癌和結腸癌等在內的多種類型的PDX模型[14-17]，這些模型中的腫瘤組織具有與原發腫瘤相似的主要組織學和遺傳學特征[18]，在一定程度上保留了原發腫瘤的異質性。

目前，構建PDX模型所用的小鼠種類較多，采用不同小鼠所形成的PDX模型的移植成功率存在差異。一項系統性研究顯示，在制備PDX模型的研究中，異種移植成功率由低到高的免疫缺陷小鼠依次為無胸腺裸鼠、重度聯合免疫缺陷(severe combined immunodeficient，SCID)小鼠、非肥胖糖尿病/重癥聯合免疫缺陷(non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency，NOD/SCID)小鼠和重度免疫缺陷(NOD.Cg-PrkdcscidII2rgtm1Sug/JicCrl，NOG)小鼠[19]。NOD/SCID小鼠是SCID 小鼠與非肥胖糖尿病小鼠品系回交的免疫缺陷鼠，其不僅具有SCID 小鼠的特征，如缺乏功能性T 細胞和B 細胞，還具有非肥胖糖尿病小鼠的多種固有免疫缺陷的特點[20]。白細胞介素-2受體γ鏈(interleukin-2 receptor γ chain，IL-2Rγ)基因缺乏的NOD/SCID 小鼠又被稱為嚴重免疫缺陷(NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtml/Bcgen，NSG)小鼠，是在NOD/SCID 小鼠基礎上敲除IL-2Rγ基因，從而使其缺失成熟T淋巴細胞、B淋巴細胞及自然殺傷(natural killer,NK) 細胞，其免疫缺陷最嚴重，是異種移植、人源化小鼠、免疫重建的重要載體[21-22]。NOG 小鼠缺乏成熟的T、B 細胞和NK 細胞，補體活性減少，巨噬細胞和樹突狀細胞功能紊亂[23]。與NOD/SCID 小鼠相比，NOG小鼠的人體細胞和組織移植存活率顯著提高，可成為人類免疫細胞移植的理想模型。雖然，關于構建PDX模型選用何種小鼠尚無統一明確的觀點，但其共同點均為免疫缺陷小鼠。

1.3 腫瘤移植部位的選擇目前的研究中最常見的腫瘤移植部位有原位移植和皮下移植，但不同移植部位對異種移植物的生長會有所影響。原位移植是將人類腫瘤組織接種到與腫瘤原發部位相對應的移植宿主的組織器官內，使其獲得與人體腫瘤相似的微環境。該移植方式高度還原了腫瘤細胞及其周圍間質之間組織微環境的相互作用及腫瘤生長情況。PAN等[24]將從患者身上所獲取的膀胱腫瘤組織裂解為單細胞懸液，并植入NSG 小鼠的膀胱內，建立了膀胱癌原位PDX模型。但這種移植技術難度系數較高，不易于操作。相比而言，皮下移植瘤模型操作簡單，成瘤率高，并能方便、實時檢測腫瘤的生長情況和評估藥物治療效果。皮下移植為最常見的異種移植部位，通常于小鼠的腎包膜下或雙側腎囊以及小鼠側腹部移植腫瘤組織并能連續傳代[25-27]。在腎包膜下接種患者腫瘤組織也被證實是最可靠的移植部位，這可能與移植部位的血液供應豐富、新血管快速生成有關。盡管腎囊并不是膀胱癌的生理初始位置，但卻是PDX 模型存活和生長的最佳移植部位。有學者在小鼠雙側腎囊下注射患者膀胱腫瘤組織后，成功構建了PDX 模型[25]。總體而言，原位移植和皮下移植存在互補關系，前者能評估腫瘤微環境中的特異性，而后者有利于研究上皮-基質相互作用在腫瘤生長中的意義。因此，尚無研究明確表示PDX 模型的最佳移植部位。

2 PDX模型在膀胱癌研究中的應用

膀胱癌是最常見的癌癥之一，其具有高復發率及高進展率等特點。近年來，膀胱癌的發病率和病死率呈逐漸上升趨勢，成為嚴重威脅人類健康的主要疾病[28]。雖然新的膀胱癌治療方法不斷涌現，但其治療研究進展受到體內外實驗條件的限制。動物腫瘤模型是研究癌癥進展的有效工具。PDX 模型是目前最常用的癌癥治療研究的體內模型之一[29]，該模型不僅能很好地保留患者腫瘤的生物學特征，還再現了腫瘤異質性[30]。20世紀70年代，WELDON等[31]首次建立了將癌細胞遞送到膀胱腔內的動物模型構建方法，目前此方法已廣泛應用于膀胱癌治療領域的基礎研究。有研究使用細胞解離劑將培養為球體的膀胱癌患者來源的癌癥細胞(patient-derived cancer cell，PDC)分解為單個懸浮細胞，并將其注射到免疫缺陷雄性NOG小鼠的腹側皮下而成功建立了PDX 模型；蘇木精-伊紅染色顯示，由PDC衍生的異種移植腫瘤能表現出與原發腫瘤相似的形態特征[32]，有望成為研究膀胱癌致瘤性和耐藥性的重要載體，并有利于未來傳統腫瘤治療模式向精準化、個體化的發展。目前，PDX模型被用于腫瘤患者的臨床前藥物評估、生物標志物識別以及個性化藥物研發，以預測腫瘤患者的臨床治療效果[33]。目前，有學者在基于膀胱癌PDX 模型的應用條件下，采用噻唑藍比色法篩選出了治療膀胱癌的藥物組合[24]。另外，有研究表明，按照臨床劑量的聯合用藥方式能有效減緩膀胱癌PDX模型的生長[34]，這可能對一些膀胱癌患者的治療研究有益。也有研究表明，在鑒別高危膀胱癌及發現膀胱癌生物標志物方面，PDX模型都發揮著重要作用[35]。這些發現為膀胱癌患者治療方案的選擇提供了參考依據。另外，相應的PDX模型臨床前試驗結果已經被證實與腫瘤患者的相關研究結果一致[36-37]，這進一步表明了該模型能很好地概括人類腫瘤的組織學特點、分子特征和腫瘤異質性，為腫瘤精準治療的發展提供了相關依據，為優化膀胱癌患者的個性化治療提供了研究方向。

3 PDX模型的優勢和不足

近年來，動物模型被廣泛用于癌癥研究，如由癌細胞系和基因工程小鼠模型開發的小鼠異種移植模型。盡管這些模型對癌癥研究做出了巨大貢獻，但在精準醫學時代，它們未能滿足不同患者的特定需求。PDX 模型在精準醫學方面具有一定的獨特優勢，這是其他癌癥模型無法比擬的。PDX模型的基本特征主要包含每個異種移植物都來自于隨機選擇的臨床患者的腫瘤組織，與其供體組織具有相同的遺傳背景，更利于將該模型應用于藥物暴露研究，為不同患者提供特定需求及治療。有學者認為,若是利用PDX模型進一步明確癌癥干細胞的性質，將有助于研發針對癌癥干細胞或同時針對其他癌癥細胞的有效治療方案[37]。這些研究表明，PDX 模型有利于加速藥物開發的研究，也易于將患者衍生的癌癥模型轉化為臨床應用，從而給予新的治療建議。

雖然PDX 模型具有保留原發腫瘤組織學和分子特征的優勢，但該模型在臨床應用方面的價值仍具有諸多不足。首先，PDX模型需要手術切除患者的腫瘤組織用于培養異種移植物，但部分癌癥患者并不接受任何腫瘤組織的手術切除術，且手術切除率因癌癥類型多樣而存在較大差異。較低的手術切除率不僅降低了患者腫瘤組織的獲取率，還增加了PDX 模型構建的難度系數。其次，PDX模型的建立存在成本高、開發時間長(最多6個月)及移植率低的問題[38]。一般建立第1個PDX 模型通常需要4～5個月，而隨后的PDX 傳代仍需2～5周，如前列腺癌 PDX的生長速度較慢，需要數月才能生成模型[39]。通常為了增加移植成功率，會使用基質凝膠培養腫瘤組織，還會在微室中進行培養。這種由微室培養的方式與基質凝膠的培養效果基本一致，且傳代周期顯著縮短。據報道，條件重編程(conditional reprogramming，CR)技術可持續擴增細胞譜系，維持活檢中細胞的異質性[40]。這種技術能夠在體外擴增PDX 細胞或應用于高通量藥物篩選試驗及體外操作，可減少動物使用數量、腫瘤組織的變異性和研究成本。CR 技術能潛在地彌補體內PDX 模型的不足，并用于靶向治療的轉化性研究和開發。相對而言，CR 技術的發展速度更快，成本也較低。因此，CR 技術可作為體內PDX 模型的一種快速、低成本的替代方案。再次，雖然PDX 模型多選擇腎包膜下移植或原位移植方式，但這2種移植方法的操作難度系數較高，通常需要影像學檢測技術的輔助。最后，PDX模型常選用免疫缺陷小鼠為實驗動物，以保持原發腫瘤組織的異質性，但由于宿主小鼠缺乏人體特定的免疫系統，使得該模型在免疫反應研究中存在一定程度的局限性。

總之，PDX 模型已被證明是一種具有高度預測能力的實驗工具，可用于測試標準化學治療后的治療效果和識別受益于臨床試驗中新療法的腫瘤類型。PDX模型是通過把個體患者的腫瘤組織移植到免疫功能低下的動物如嚴重免疫缺陷小鼠或裸鼠的體內而形成，所以該模型的異種移植物仍保留了原始腫瘤的細胞結構和分子標志。因此，PDX 模型再現了原發疾病的生物學特征，適用于評估單個患者的癌癥化學治療敏感性，為癌癥治療領域提供了一個潛在研究工具。

4 結語

越來越多的研究表明，膀胱癌PDX模型在藥物篩選、生物標志物開發和聯合臨床試驗等方面具有一定優勢，但由于其免疫系統缺乏、移植成功率低、建模成本昂貴及時間較長等原因，使得PDX模型的應用具有局限性。盡管如此，膀胱癌PDX模型這一類癌癥臨床前模型對于臨床治療領域的研究仍然是至關重要的。因此，人們需要對PDX模型的研究進行不斷的完善與改進，從而推動其更好地發展。