傳統發酵毛豆腐的研究進展

◎ 張繼輝，趙丹丹

（蕪湖職業技術學院 食品科學與生物工程學院，蕪湖生命與健康工程研究中心，安徽 蕪湖 241000）

毛豆腐是我國中部地區流行的豆類發酵食品，以皖南徽州地區生產的毛豆腐最具風味，是一種由霉菌發酵而成并由白色真菌菌絲覆蓋的大豆蛋白豆腐，烹飪方法多樣，味道鮮美。毛豆腐的生產一般以手工家庭作坊式生產為主，通過霉菌發酵制備而成，由于其是在自然環境下發酵，參與發酵的微生物種類多樣，主要是毛霉。毛霉發酵制成的毛豆腐，提高了某些營養素的生物利用度，改變了豆腐的質地和風味。

1 毛豆腐加工工藝進展

1.1 傳統加工工藝

徽州毛豆腐的傳統制作工藝是用含有大量環境微生物的天然發酵豆腐酸水進行凝固，生產規模大部分以家庭作坊為主，如中國黃山市休寧縣的方鑫玉家庭作坊一百多年來一直使用天然發酵豆腐酸水凝結劑生產毛豆腐。具體工藝為大豆浸泡過后研磨過濾制成豆漿，然后加熱到80 ℃和天然發酵豆腐酸水 （pH ＜4.0）以1∶10的比例加入混凝。凝固后的豆漿靜置15 min，使其完全凝固，將上層豆腐黃水過濾，紗布包裹豆腐后用雙層磨具進行壓片，最后切割后形成4 cm×4 cm×3 cm的豆腐磚。隨后，在豆腐磚上噴灑毛霉孢子懸浮液[1-2]，在20 ℃的培養箱中放置4 d，濕度保持在90%左右，空氣抽吸以確保通風。

1.2 現代加工工藝

毛豆腐制作的傳統工藝一直以作坊式、經驗式和發酵粗放式為主，受環境和人為因素影響大，產品質量參差不齊。有相關研究者檢測出傳統毛豆腐生產車間中菌落總數為4.5 lgCFU·m-3，雜菌污染會敗壞毛豆腐的品質，還會引起有害物質如生物胺的累積，直接影響毛豆腐的口感[3-7]。國內對毛豆腐的現代加工工藝研究較少，部分學者從發酵條件和發酵菌種上進行了現代加工工藝的研究。

李然等[8]通過正交優化的方法探究了毛豆腐達到最佳食用品質時所需的發酵條件，結果顯示發酵時間4 d、 發酵溫度25 ℃、刷鹽液濃度2%為最佳發酵條件，將刷鹽液濃度為2%的豆腐胚在20 ℃的條件下培養4 d， 毛豆腐氨基酸態氮的含量隨著發酵時間的延長不斷增多。李婷婷[9]將毛霉菌LMM1和副干酪乳桿菌LMX1按1∶1的比例人工強化接種于豆腐胚表面，在15 ℃下恒溫培養3 d可以得到發酵性狀良好的毛豆腐。

2 毛豆腐制作過程中微生物菌群落結構研究

目前，關于毛豆腐的微生物學研究還不充分，但國內學者通過傳統培養法、16s DNA測序以及宏基因組測序等方法對毛豆腐及制作過程中的微生物進行了鑒定、分離和研究。ZHAO等[10]研究發現毛霉是毛豆腐的主要發酵劑，毛豆腐的發酵受原料和環境因素的影響，包括溫度、濕度、發酵時間和加工條件等。

王磊等[11]采用傳統培養法從云南毛豆腐中分離得到總狀毛霉、無根根霉、黃曲霉、白地霉和常見青霉，其中毛豆腐中的優勢菌為無根根霉和總狀毛霉。李婷婷[9]從傳統徽州毛豆腐中分離篩選出一株產蛋白酶高大毛霉菌LMM1（Mucor mucedostrain LMM1 ）和一株產蛋白酶副干酪乳桿菌LMX1（Lactobacillus paracaseistrain LMX1），并按1∶1的比例人工強化接種于豆腐胚表面，在15 ℃下恒溫培養3 d得到了發酵性狀良好的毛豆腐。YAN等[1]利用聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電泳技術鑒定了來源于毛豆腐傳統發酵過程中的天然發酵酸水中的細菌。結果表明，厄爾納拉乳桿菌（Lactobacillus ultunensis）、金腸球菌（Enterococcusbulliens）、格氏乳桿菌（Lactobacillus graminis）、德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）、德氏乳桿菌亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis）和黏膜乳桿菌（Lactobacillus mucosae）是毛豆腐發酵的主要細菌。同時采用培養法從天然發酵酸水中分離出6種乳酸菌，并分析其產酸能力，發現德氏乳桿菌的乳酸含量最高，模擬混凝進一步證實德氏乳桿菌生產的豆腐磚質量最好，表明德氏乳桿菌可能是徽州毛豆腐傳統生產過程中合成風味化合物的核心功能微生物。

BENUCCI等[12]采用高通量測序法對云南4個菜市場毛豆腐的真菌和細菌群落多樣性進行了分析。結果表明，該地區毛豆腐大約由170個真菌和365個細菌類群組成，不同市場的微生物類群不同。真菌主要由子囊菌屬（Ascomycota）、擔子菌屬（Basidiomycota）和毛菌屬（Mucoromycota）組成，其中毛霉菌尤為豐富，也與之前的研究結論相符合。毛霉菌通過蛋白質水解過程和營養物質的釋放影響最終產品的質量[10-13]。細菌群落以變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidota）為主。在所有類群中，幾乎所有樣本中都存在屬于乳酸菌的乳桿菌屬（Lactobacillus）和明串珠菌屬（Leuconostoc），這些細菌在發酵食品中普遍存在，并已報道在大豆發酵產品中存在，且具有抗菌和抗氧化特性、清除自由基和產生活性肽的功能[14-15]。

3 毛豆腐發酵的主要影響因素

3.1 發酵溫度

發酵溫度是毛豆腐發酵過程中的關鍵因素，微生物的生長也受溫度的直接控制，同時微生物所釋放的蛋白酶類催化活性也與溫度密切相關。豆腐蛋白在發酵過程中被微生物酶水解為低分子量的多肽，這些化合物具有生物活性[16]。此外，部分多肽及其釋放的氨還能轉化為酸、醇等多種揮發性風味化合物，直接決定了毛豆腐的風味和品質[17]。然而，自然發酵的毛豆腐由于溫度難以控制，導致成品質量參差不齊，風味不一。李然等[8]通過正交試驗對發酵條件進行優化，得出20 ℃下發酵的毛豆腐感官評分最高，這也與休寧方鑫玉家庭作坊傳統發酵工藝的發酵溫度一致[1]。李婷婷等[9]將高大毛霉菌LMM1與副干酪乳桿菌LMX1以1∶1比例混菌接種發酵，發現發酵溫度為15 ℃時培養的毛豆腐綜合評分最高。以上研究均為毛豆腐發酵溫度的確定提供了技術參考。

3.2 發酵時間

發酵時間決定了毛豆腐的發酵程度。發酵時間較短，豆腐蛋白未能及時被微生物釋放的蛋白酶分解，風味物質釋放不充分，導致發酵不充分，成品沒有發酵過后的醇香；發酵時間過長則會導致成品過熟，從而發生腐敗，影響成品質量。毛豆腐傳統發酵工藝的發酵時間一般為3～7 d，具體根據發酵溫度和菌絲生長情況而定。李然等[8]通過正交試驗得出最佳發酵時間為4 d，與傳統發酵工藝發酵時間一致[1]。李婷婷等[9]使用混菌接種發酵得出最佳發酵時間為3 d，時間縮短可能與接種菌劑有直接關系。

4 毛豆腐發酵過程中理化指標分析

4.1 毛豆腐的質地變化

在毛豆腐發酵過程中其質地會發生明顯的變化。ZHAO等[10]對毛豆腐質地特征分析的結果表明，隨著發酵過程的延長，毛豆腐的黏附性呈增加趨勢，硬度、內聚性和彈性呈降低趨勢。毛豆腐發酵過程中水分流失導致蛋白質濃度增加，黏附性增加。隨著發酵時間的延長，大豆蛋白被毛霉菌分泌的蛋白酶降解為低分子量的蛋白片段，破壞了蛋白質形成的網絡結構，可能導致毛豆腐硬度的降低。內聚性是描述刺激構成產品主體的內部鍵強度所需的力的參數，由于發酵過程中發生了蛋白質水解，構成蛋白質基質的鍵的數量和強度被破壞，因此發酵毛豆腐的內聚性明顯低于未發酵的豆腐[18]。毛豆腐彈性的降低可能與水分的降低也有直接關系，這是因為水是一種增塑劑，彈性可能會隨著水分的減少而降低[19]。

4.2 毛豆腐的營養成分

豆制品本身的營養成分十分豐富，含有40%左右的蛋白質、18%的脂肪、25%的碳水化合物、5%的礦物質以及豐富的B族維生素等[20]。發酵以后豆制品中的大分子物質，如蛋白質、脂類以及碳水化合物在酶的作用下水解為肽、氨基酸、脂肪酸和單糖等小分子物質，這些小分子物質是形成發酵豆制品特殊風味的關鍵物質[21]。

水溶性蛋白質和氨基氮是黃山毛豆腐的主要營養成分。YAN等[1]研究發現隨著真菌在發酵過程中的生長代謝，蛋白酶水平逐漸升高，蛋白質被降解為蛋白胨、多肽、氨基酸等微生物生長的中間體。因此，隨著發酵的進行，可溶性蛋白的總體含量逐漸增加。同樣，在發酵過程中，由于真菌蛋白酶介導水解豆腐蛋白，導致氨基酸氮含量增加。毛豆腐作為一種典型的發酵大豆產品具有更強的抗氧化和抗腫瘤特性[22]。有研究也報道了發酵豆制品除了具有免疫功能外，還對高血壓、糖尿病和炎癥也有顯著的治療作用[23]。毛豆腐的鮮味濃郁主要是因為它含有谷氨酸等多種氨基酸，氨基氮含量的增加對毛豆腐風味的改善起到了關鍵作用。

此外，YAN等[1]還發現毛豆腐的還原糖含量在發酵過程中先增加后降低，最初的增加可能是由于豆腐淀粉被淀粉酶水解，隨著真菌的增殖，還原糖成為碳和能量的主要來源。同時，還原糖還參與了谷氨酸等氨基酸的生成，導致其在發酵2 d后含量下降。大豆總碳水化合物含量約為25%～30%，主要包括淀粉、低聚糖和膳食纖維，其中低聚糖占總碳水化合物的10%。大豆低聚糖的主要糖類是棉子糖和蔗糖，不能被人體直接消化吸收[24]。然而，真菌生長過程中所釋放的α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和α-半乳糖苷酶等，最終會將多糖分解為糊精和低聚糖，再進一步分解為葡萄糖和其他易被利用的糖，從而大大提高了毛豆腐中多糖的利用率。

發酵微生物在代謝過程中產生的脂肪酶將大豆中的脂類物質逐級降解為小分子的酯、脂肪酸和醇類物質。毛豆腐也不例外，在發酵的過程中一部分脂肪酸在其他酶類的協同作用下進一步分解為小分子的揮發性醛、酸或醇類物質，另一部分脂肪酸和醇類結合形成芳香族化合物，賦予毛豆腐特有的香氣[25]。

4.3 毛豆腐的揮發性成分

毛豆腐因其獨特的發酵工藝而具有特殊的風味，揮發性物質是毛豆腐發酵過程中的主要風味物質，這些風味物質是由發酵過程中各種酶促反應產生的[26]。YAN等[1]在黃山毛豆腐中鑒定和定量了44種揮發性化合物，包括9種酯、9種酸、8種醇、5種醛、4種烯烴、3種酮、2種苯、2種酚、1種呋喃和1種吲哚。樣品毛豆腐揮發性化合物總量為3.156～16.016 μg·g-1， 發酵過程中所有樣品的主要化合物為醇和酸，這些化合物大部分在其他發酵食品如醬油、大醬和韓國大醬中均有報道[27-29]。其中，酸性物質對黃山毛豆腐的風味有重要影響。有研究表明發酵培養基中有機酸的存在抑制了污染細菌的生長，增加了發酵產品的醇厚、回味和風味[30]。而毛豆腐中的醇以1-辛烯-3-醇、苯乙醇和庚醇最為常見，其中1-辛烯-3-醇含量尤其豐富。1-辛烯-3-醇是真菌中普遍存在的揮發性化合物，其也存在于豆科植物中[31-32]，有研究者從米酒、小麥曲和清酒曲中也分離得到了1-辛烯-3-醇[33]。

毛豆腐中還含有醛類、酮類和酚類等揮發性物質。其中，苯甲醛是黃山毛豆腐中最重要的一種醛，它賦予毛豆腐苦杏仁的香氣。苯甲醛的形成是苯甲醇氧化的結果，或是芳香族氨基酸（如苯基羥基苯甲酸和對乙酸）的微生物分解的結果。毛豆腐中的揮發性酚類物質有愈創木酚和苯酚，愈創木酚賦予發酵豆腐辛辣和煙熏的香氣，該物質主要通過對香豆酸和阿魏酸的酶促或熱脫羧形成的[34]。

5 結語

目前，徽州毛豆腐依然以手工作坊的生產方式為主，發酵條件靠經驗把控，發酵技術靠代代相傳，沒有形成具體的生產標準，導致生產的產品質量不一，經不起考量。自然發酵受環境影響巨大，環境中微生物種類復雜多樣，接種時具有不確定性和不穩定性，直接影響毛豆腐的品質。同時手工生產限制了毛豆腐的擴大生產和銷售，直接阻礙了產業的發展。因此，應繼續加大對毛豆腐發酵過程中微生物群落多樣性的研究，篩選出有益發酵菌種，進行定向接種發酵，控制產品品質。生產方式應逐漸從家庭作坊式向機械化方向發展，采用手工作坊和機械化相結合的生產方式，既能保留手工作坊式生產的特殊風味，又能增產增量，擴大市場。此外，還應調整毛豆腐產業的結構，加強毛豆腐的豆腐胚制作、發酵、銷售等環節的標準化，打造毛豆腐的特色效益等是現階段對毛豆腐家庭作坊及企業的重大考驗，也將直接影響整個產業的發展。