中性粒細胞胞外誘捕網水平聯合肺功能指標對支氣管哮喘急性發作的預測價值

周偉勇，吳 升

開平市中心醫院呼吸內科，廣東 開平 529300

支氣管哮喘是一種由呼吸道過敏引起的，以支氣管可逆性發作性痙攣為特征的慢性阻塞性炎性疾病。臨床表現為反復發作的伴有哮鳴音的呼氣性呼吸困難、咳嗽、胸悶等癥狀。由于支氣管哮喘的病因復雜，有通過接觸灰塵和花粉等引起哮喘的過敏原，還有因為服用藥品引起的支氣管哮喘。支氣管哮喘的發作機制也十分復雜，臨床對于支氣管哮喘的診斷既沒有金標準，也沒有實驗室檢查指標能夠明確預測支氣管哮喘，故臨床對于支氣管哮喘的診斷依托于患者的主訴，查體和肺功能檢查。這種確診方式也有其局限性：一是肺功能檢查能否準確地反映患者氣道情況取決于患者的依從性，若患者為兒童，不能按要求正確進行檢查，會造成肺功能檢查結果不準確；若患者為老年人，隨著年齡增大，并且多種心血管疾病與呼吸疾病并存，常常會有呼吸困難的癥狀，這樣的情況進行肺功能檢查得到的結果不夠準確，不能夠正確反映患者的氣道情況。二是肺功能檢查結果只能反映呼吸道的氣流狀況，不能檢測呼吸道是否有炎癥，但在診斷哮喘時呼吸道炎癥的診斷是核心要素［1］。中性粒細胞是炎癥反應時最早出現的細胞［2］，當中性粒細胞受到刺激后，釋放到胞外的一種網狀結構成為中性粒細胞胞外誘捕網，故臨床可以通過檢驗中性粒細胞胞外誘捕網水平評價呼吸道的炎癥狀況。本研究旨在探究中性粒細胞胞外誘捕網水平聯合肺功能指標對支氣管哮喘急性發作的預測價值，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年2—12月開平市中心醫院呼吸內科收治的90例主訴喘息、胸悶、氣短患者作為研究對象。納入標準：（1）患者主訴反復的喘息、氣急，咳嗽，且發作時間常常夜間及晨間多發，在接觸到冷空氣或者各種呼吸道的刺激及運動后癥狀明顯。（2）有過以往支氣管哮喘發作史，并且使用相關藥物癥狀得到改善。（3）患者病程為急性發作期，聽診時雙肺可聽到彌漫性哮鳴音，呼氣相延長。患者符合上述（1）（3）癥狀，并且肺功能檢查任意一項為陽性患者歸為支氣管哮喘急性發作組。患者有上述（1）（2）癥狀，并且肺功能檢查任意一項為陽性列為支氣管哮喘非急性發作組。（4）患者具有良好的依從性。

支氣管哮喘急性發作組（45例），男性患者30例，女性患者15例；年齡15～67歲，平均年齡（43.04±12.77）歲。支氣管哮喘非急性發作組（45例），男性28例，女性17例；年齡12～71歲，平均年齡（46.07±13.65）歲。兩組患者一般資料具有可比性（P＞0.05）。本研究經醫院醫學倫理委員會審批通過。

1.2 檢測方法

1.2.1 肺功能檢查 （1）支氣管激發試驗：采用不同的刺激物去引發支氣管不正常的收縮，通過刺激物的量化及其相應的反應程度，去判斷氣道高反應性的程度，只針對非急性期患者進行試驗。（2）支氣管舒張試驗：患者用力呼氣，記錄第一秒呼氣容積，吸入支氣管舒張劑后，再記錄第1 s用力呼氣容積，若第1 s用力呼氣容積增加＞12%，且第1 s用力呼氣容積增加絕對值＞200 mL，則支氣管舒張試驗陽性。（3）呼氣流量峰值（PEF）平均每日晝夜變異率：患者早上起床后使用肺功能檢查峰流量計測量呼氣流量峰值，保持站立位，患者快速深吸一口氣至肺總量位，迅速將咬口含入口腔，用嘴唇包緊，立即用最大力氣和最快速度將肺內氣體呼出，檢查結束后峰流量計應繼續保持水平位，讀取數值。至少檢查3次，若3次實測值之間差異過大，應注意檢查方法是否正確?？芍貜投啻?，使最佳3次之間差異＜5%，取最高值記為呼氣流量峰值，晚上入睡前重復此步驟，連續監測2周，將每天的變異率相加除以監測天數（最少7 d）以計算呼氣流量峰值平均變異率，每日呼氣流量峰值晝夜變異率之和/7）＞10%，則為陽性；或以2周內呼氣流量峰值最高值和最低值計算呼氣流量峰值周變異率，（2周內最高PEF-最低PEF）/［（2周內最高PEF+最低PEF）×1/2］×100%］＞20%［3］，則為陽性。

1.2.2 中性粒細胞胞外誘捕網水平檢查 購買小牛胸腺DNA干粉（北京百奧萊博科技有限公司）后，用倍比稀釋方法稀釋后，加入PicoGreen工作液并混勻，用熒光酶標儀于在485 nm波長處的發射熒光下快速檢測，以小牛胸腺DNA干粉對應的熒光強度作為標準曲線，抽取兩組患者的血液，將待測血液與PicoGreen熒光探針工作液進行混合，使用熒光酶標儀于在485 nm波長處檢測。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行分析。分別對各組資料進行統計學描述。其中計量資料符合正態分布且方差齊時采用t檢驗，不符合正態分布且方差不齊時采用秩和檢驗。計數資料比較采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者的肺功能指標情況

急性發作組患者的肺功能檢查陽性率為100%，非急性發作組患者的肺功能檢查陽性率為40%，差異有統計學意義（χ2=35.767 2，P＜0.01）。

2.2 兩組患者中性粒細胞胞外誘捕網水平情況

急性發作組患者的中性粒細胞胞外誘捕網水平為（1 505.04±210.90），非急性發作組的中性粒細胞胞外誘捕網水平為（1 015.71±247.76），差異有統計學意義（t=10.088 7，P=0）。

2.3 支氣管哮喘急性發作期logistic回歸分析

2.3.1 影響患者支氣管哮喘急性發作的控制變量篩選 患者的性別對患者支氣管哮喘急性發作，差異有統計學意義（P＜0.05），患者的年齡對支氣管哮喘急性發作，差異無統計學意義（P＞0.05），患者的性別對支氣管哮喘發作的影響構成混雜影響，見表1。相關因素賦值，見表2。

表1 患者支氣管哮喘急性發作的控制變量篩選 例

表2 相關因素賦值

經霍斯默—萊梅肖檢驗，差異無統計學意義（χ2=7.65 0，P=0.468），二元logistic回歸模型與真實數據擬合良好。性別對支氣管急性發作的影響（P=0.979），不是支氣管哮喘急性發作的獨立影響因素；肺功能指標對支氣管急性發作的影響（P=0.998），故在支氣管哮喘急性發作與支氣管非急性發作中肺功能指標不構成影響因素；中性粒細胞胞外誘捕網水平對支氣管急性發作的影響，在支氣管哮喘急性發作與支氣管非急性發作中，中性粒細胞胞外誘捕網水平差異明顯，可以顯著影響支氣管哮喘的急性發作，排除混雜因素的影響后，OR=1.009，中性粒細胞胞外誘捕網水平每提高一個單位，患病風險提高0.9%，見表3。

表3 中性粒細胞胞外誘捕網水平和肺功能指標對支氣管哮喘急性發作線性回歸分析結果

3 討論

支氣管哮喘是一種氣道高反應性炎癥疾病，受到多種影響因素影響：一是由于個體基因遺傳導致的個體差異性大，使得有個體超敏體質的患者更容易受到變應原的影響，每個個體對變應原的反應都不同。二是環境中的變應原多種多樣，空氣中的塵螨、花粉、動物皮毛都會引起氣道的炎癥形成與氣道高反應性，甚至導致氣道重構。變應原刺激呼吸道誘導多種炎癥細胞聚集在呼吸道部位，如中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞等。炎癥細胞聚集在呼吸道部位，氣道高反應性是長期慢性氣道炎癥的結果，表現為患者接觸變應原時氣道出現的過強或過早的收縮反應。肺功能檢查是檢查患者的氣道反應性的項目，可以反映出患者的氣道狀態，但是氣道反應性是炎癥長期慢性作用的結果，肺功能檢查無法檢查出現在氣道的炎癥狀況，故臨床可以通過肺功能檢查聯合患者的主訴與體征對患者進行確診，但無法確定患者此時氣道的炎癥狀況。確定患者的炎癥狀況是支氣管哮喘診斷的核心，這將直接影響患者后續的治療方案。

中性粒細胞是炎癥細胞的一種，還包括嗜酸性粒細胞，嗜堿性粒細胞等，中性粒細胞可以吞噬病原體并在胞內釋放顆粒內容物和活性氧殺害病原體，發揮其天然免疫功能，中性粒細胞也可將顆粒內容物和活性氧釋放到細胞外空間，破壞周圍的外來物［5］。中性粒細胞分泌的組蛋白、DNA和蛋白酶就會在細胞外形成交織的網狀結構［6］，這種網狀結構就是中性粒細胞胞外誘捕網。其在呼吸道部位是機體防御變應原時形成的保護機制，但是同時中性粒細胞胞外誘捕網的形成也會介導炎癥介質的釋放，引起呼吸道部位的黏膜水腫，并且中性粒細胞胞外誘捕網也會損傷自身細胞，損傷氣道上皮細胞，誘導炎癥細胞分泌黏液，刺激患者的氣道出現高反應性，導致氣道阻塞，患者呼吸困難與喘憋加重，加重哮喘癥狀［7］，并且中性粒細胞可以減少肺泡巨噬細胞降解中性粒細胞胞外誘捕網的能力，使得這種不良的循環持續存在，使支氣管哮喘持續發生［8］。

中性粒細胞胞外誘捕網是氣道炎癥反應形式的一種，故中性粒細胞胞外誘捕網的檢測可以反映呼吸道的情況。支氣管哮喘根據發病情況可分為急性發作期，慢性持續期與緩解期。根據哮喘的分期不同采用不同的治療方案，與急性期不同，慢性持續期與緩解期，患者的氣道未處于痙攣的狀態，氣道的炎癥反應也未處于炎癥風暴，故對患者的藥物使用劑量，治療方案都要相互區別，臨床對急性期與非急性期的鑒別尤為重要。中性粒細胞胞外誘捕網的檢測為急性期與非急性期的鑒別提供了一種臨床思路。

目前，對于中性粒細胞胞外誘捕網水平的檢測采用PicoGreen熒光染色法，中性粒細胞會釋放到胞外DNA，故臨床可以通過檢驗血液中DNA的水平來評價中性粒細胞胞外誘捕網水平。PicoGreen熒光染色法是一種使用Pico-Green熒光染料與樣品中雙鏈DNA的高度特異性結合而產生熒光信號，再使用Modlus熒光檢測儀定量檢測DNA含量的方法。傳統檢測DNA的方法是直接檢測在260 nm處的光吸收值，不僅雙鏈DNA，單鏈DNA，RNA和其他雜質也會產生吸收值，這樣通過DNA水平去評價中性粒細胞胞外誘捕網水平不準確。通過PCR擴增后進行通過電泳檢測DNA，但是這種方法無法確定DNA是否來自中性粒細胞胞外誘捕網，還是來自組織的破裂，并且過程容易受到環境的污染［9］。PicoGreen是一種和DNA特異性絡合的分子探針，在485 nm波長處發射黃光，與RNA和單鏈DNA結合無熒光，并且發射熒光的強度與DNA的濃度成正比?？梢詫崿F定量檢測DNA來評價體內中性粒細胞胞外誘捕網水平。

據相關研究表明，支氣管哮喘根據炎癥細胞浸潤的類型可以分為中性粒細胞表型、嗜酸性粒細胞表型、嗜堿性粒細胞表型。根據支氣管哮喘急性發作期的治療方案，給予患者β2受體激動劑擴張支氣管，聯合糖皮質激素發揮抗炎作用。有研究［10］表明，對支氣管哮喘患者使用糖皮質激素發揮抗炎作用時，糖皮質激素對有些中性粒細胞表型患者無效，反而加重病程，這是因為糖皮質激素對嗜酸性粒細胞型支氣管哮喘具有良好的治療作用，但是對一些哮喘患者來說，肺部灌洗液中中性粒細胞和中性粒細胞胞外誘捕網水平的數量遠遠超過肺內嗜酸性粒細胞的數量。故急性發作期患者的用藥方案根據中性粒細胞胞外誘捕網水平將更具有針對性，重組人DNase與糖皮質激素結合使用治療哮喘對中性粒細胞型支氣管哮喘更有效［11］。

本研究結果顯示，急性發作組患者的肺功能檢查陽性率顯著高于非急性發作組，急性發作組患者的中性粒細胞胞外誘捕網水平顯著高于非急性發作組，在本研究中性別不是支氣管急性發作的獨立影響因素。肺功能指標在支氣管哮喘急性發作與支氣管非急性發作中不構成獨立影響因素，故臨床通過肺功能指標可以區分支氣管哮喘與非哮喘，但是無法準確區分急性發作期與非急性發作期。中性粒細胞胞外誘捕網水平對支氣管急性發作的影響明顯，可以顯著影響支氣管哮喘的急性發作，排除混雜因素的影響后，中性粒細胞胞外誘捕網水平每提高一個單位，患病風險提高0.9%，故臨床通過檢測中性粒細胞胞外誘捕網水平聯合肺功能指標檢查對支氣管哮喘急性發作有預測作用。