LAPTM4B與肺癌多基因突變狀態及EGFR-TKIs耐藥關系的分析

紀曉坤，馬 陽，郭 曉，劉 穎，趙銀環，吳家寧，董律吏，杜 蕓

目前，靶向治療是非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)臨床治療的重要手段和方法。美國國立綜合癌癥網絡(National Comprehensive Cancer Network, NCCN)指南推薦表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor recep-tor-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs)可作為敏感表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)突變患者的一線治療[1]。EGFR-TKIs能有效抑制EGFR敏感突變腫瘤的增殖、侵襲及轉移，用藥初期可獲得良好的效果，但隨后會出現明顯耐藥現象，嚴重影響治療效果和預后。溶酶體相關跨膜蛋白4B(lysosomal-associated transmembrane protein 4B, LAPTM4B)缺失增加了細胞膜通透性、pH值、組織蛋白酶釋放和細胞凋亡，在大多數腫瘤中過表達，與腫瘤增殖、耐藥，侵襲和轉移密切相關[2-4]。據文獻報道LAPTM4B與EGFR關系密切[5]，但是LAPTM4B與NSCLC多基因突變狀態及EGFR-TKIs耐藥的關系尚不完全清楚。本實驗首先采用實時熒光定量PCR法及免疫細胞化學染色檢測464例NSCLC細胞學標本多基因突變狀態及LAPTM4B蛋白表達，探討LAPTM4B表達與多基因突變及臨床病理特征的關系；分析31例EGFR-TKIs靶向治療前標本的LAPTM4B蛋白表達，評估EGFR-TKIs治療繼發耐藥基因T790M突變后LAPTM4B表達的變化，并探究LAPTM4B在EGFR-TKIs繼發耐藥中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年1月～2021年10月河北醫科大學第四醫院癌檢中心經HE及免疫細胞化學染色確診為NSCLC的464例胸水及細針穿刺細胞學標本，離心沉淀，經10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋等步驟制成細胞快[6]；并收集其中31例EGFR-TKIs靶向治療前的標本及基因檢測結果。

1.2 方法

1.2.1實時熒光定量PCR 采用實時熒光定量PCR法檢測EGFR基因(18～21號外顯子)突變、ALK基因融合、ROS1基因融合、RET基因融合、K-RAS基因(2號外顯子)突變、BRAF基因(15號外顯子)突變、HER-2基因(20號外顯子)突變、NRAS基因(3號外顯子)突變、PIK3CA基因(20/9號外顯子)突變、c-MET基因(14號外顯子跳躍)突變。實時熒光定量PCR試劑盒購自廈門艾德生物公司，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.2.2免疫細胞化學染色 細胞塊4 μm厚切片，60 ℃烤片1 h，二甲苯脫蠟、乙醇梯度(100%、95%、70%)至水化，3%過氧化氫浸泡15 min，蒸餾水沖洗。pH 6.0的枸櫞酸鹽修復液高壓2 min，自然冷卻；PBS沖洗5 min。每張切片滴加50 μL LAPTM4B多克隆抗體(bs-9562R，Bioss公司)，4 ℃過夜。第2天，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加二抗，室溫孵育15 min；PBS沖洗3次，每次5 min。DAB顯色，終止時間視顯色強度決定。蘇木精復染細胞核3 min，鹽酸乙醇分化，氨水返藍后，梯度乙醇(70%、95%、100%)脫水，吹干后中性樹膠封固。

1.3 LAPTM4B染色結果判斷LAPTM4B染色評估由兩名經驗豐富的病理診斷醫師判讀，以陽性癌細胞百分比和染色強度為評分依據。(1)根據陽性細胞百分比進行評分：陽性細胞數<10%為0分，10%～50%為1分，>50%為2分。(2)根據細胞染色強度進行評分：未著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分。將兩項得分結果相加：0～2分為低表達組，3～4分為高表達組。

1.4 NSCLC細胞學標本分化程度判讀由兩名經驗豐富的病理醫師，綜合考慮腫瘤細胞的異型性和細胞塊的組織學形態進行判讀[7-9]。高分化：腫瘤細胞常聚集成團或簇狀，異型性小、形態相對較溫和，細胞核圓形或卵圓形，染色質均勻細膩，可見核仁；細胞質內可見分泌空泡或角化現象。細胞塊中腫瘤細胞可具有腺樣或鱗樣分化的特征，如腫瘤細胞呈腺腔樣、乳頭狀等排列或可見細胞間橋等；低分化：腫瘤細胞單個散在分布，高度異型性，可見瘤巨細胞，細胞核多形性明顯，染色質染成粗塊狀、核仁不明顯；細胞質內分泌空泡少見。細胞塊中腫瘤細胞呈實性團塊狀排列，細胞擁擠、重疊，細胞核明顯異型，染色質粗糙，核仁不明顯。中分化：介于高分化和低分化之間。

1.5 統計學分析采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，χ2檢驗或Fisher檢驗、Spearman相關性分析LAPTM4B蛋白表達與NSCLC臨床病理特征的關系。多因素Logistic回歸分析LAPTM4B蛋白表達與多基因突變狀態及EGFR-TKIs耐藥間的關系，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC細胞學標本多基因突變狀態464例NSCLC細胞學標本進行多基因突變聯合檢測，結果示單基因突變365例(78.7%)、雙基因伴隨突變14例(3%)、野生型85例(18.3%)，陽性率為81.7%。其中EGFR、ALK、ROS1、RET、KRAS、BRAF、HER-2、NRAS、c-MET基因突變率分別為59%、6%、3%、2%、4%、2%、2%、0.2%、1%。EGFR+PIK3CA、EGFR+BRAF、EGFR+HER-2、EGFR+RET、ALK+KRAS、EGFR+KRAS及RET+HER-2雙基因伴隨突變率分別為1%、0.4%、0.4%、0.4%、0.4%、0.2%、0.2%(圖1)。

圖1 464例非小細胞肺癌細胞學標本多基因突變狀態

2.2 LAPTM4B蛋白表達與NSCLC臨床病理特征的關系本組464例NSCLC中男性222例，女性242例；≤65歲者253例，>65歲者211例；高分化77例，中分化120例，低分化267例。依據LAPTM4B染色評估標準判讀LAPTM4B蛋白表達強度由低到高如圖2所示。LAPTM4B蛋白表達與患者性別、年齡無關，與腫瘤分化程度呈正相關，差異有統計學意義(P<0.001，表1)。

圖2 免疫細胞化學法檢測非小細胞肺癌中LAPTM4B蛋白表達：A.不表達；B.低表達；C.高表達

表1 LAPTM4B表達與非小細胞肺癌臨床病理特征的關系

2.3 LAPTM4B蛋白表達與多基因突變狀態的關系LAPTM4B蛋白表達與基因突變(P<0.001)及EGFR基因突變密切相關(P=0.001)；與ALK、ROS1、RET、KRAS、BRAF、HER-2、NRAS、PIK3CA、c-MET基因突變均無關(表2)?；蛲蛔冃筒±鄬τ诨蛞吧筒±?，LAPTM4B蛋白表達增高的風險增加(OR=2.94，95%CI：1.804～4.791)。

表2 LAPTM4B表達與非小細胞肺癌多基因突變狀態的關系

2.4 LAPTM4B蛋白表達與EGFR-TKIs繼發耐藥的關系31例EGFR-TKIs繼發耐藥基因T790M突變的NSCLC細胞學標本，其LAPTM4B蛋白表達水平高于與其配對的EGFR-TKIs治療前標本，差異有統計學意義(P<0.05，表3)。

表3 LAPTM4B表達與EGFR-TKIs繼發耐藥的關系

3 討論

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因，其中NSCLC占首位，5年生存率低于15%[10]。EGFR-TKIs或阿法替尼等其他ERBB酪氨酸激酶受體家族抑制劑的藥物是NSCLC患者EGFR敏感突變的標準化治療方案，在晚期NSCLC患者中其有效緩解率為56%～74%，中位生存期為10～14個月[11-12]。然而，EGFR-TKIs治療后繼發的獲得性耐藥不可避免[13-14]，50%的獲得性耐藥是由EGFR-TKIs繼發EGFR基因20號外顯子T790M突變所引起的[15]。盡管EGFR突變的患者對EGFR-TKIs高度敏感，但約10%EGFR突變的NSCLC患者表現為原發耐藥[16]。研究發現，導致EGFR-TKIs產生耐藥的機制包括T790M突變、c-Met擴增和PIK3CA突變[17-18]。由于獲得性耐藥的出現，大多數晚期NSCLC患者在開始EGFR-TKIs治療1～2年內病情進展。因此，選擇合適的治療方案需要實時動態檢測患者基因突變狀態，但現有的基因突變檢測方法成本高、耗時久，不利于EGFR-TKIs耐藥的實時預測。LAPTM4B的出現可能成為監測EGFR-TKIs耐藥的預測分子。

LAPTM4B首先在人肝細胞癌中被發現，是一種新型的致癌基因，定位于8q22.1染色體，其2個等位基因(AY219176和AY219177)分別編碼3.5×104和4.0×104的蛋白質(LAPTM4B-35和LAPTM4B-40)。LAPTM4B-35在肝細胞癌、乳腺癌等多種腫瘤中過表達，其通過AKT信號通路促進腫瘤增殖和化療耐藥，并通過富脯氨酸的結構域與參與多種信號通路的含SH3結構域的信號分子相互作用，促進腫瘤遷移、侵襲和轉移[19]。據文獻報道LAPTM4B與EGFR關系密切：(1)LAPTM4B可以通過阻斷活化的EGFR(active EGFR)腔內聚集并抑制其溶酶體降解來增強和延長EGFR信號傳導；(2)非激酶依賴性的EGFR(inactive EGFR)與LAPTM4B共同定位于早期和晚期核內體，在無血清環境中相互作用并相互穩定[5]。雖然LAPTM4B可與EGFR相互作用，但其與NSCLC多基因突變狀態及EGFR-TKIs耐藥的關系尚不清楚。

本實驗選用晚期NSCLC患者的細胞學標本為研究對象，避免疾病臨床分期及放、化療對實驗結果的影響，發現LAPTM4B表達與NSCLC病理分化程度呈正相關，且與EGFR基因突變有關，但與KRAS、PI3CA、c-MET及NRAS等基因突變均無關。既往研究發現，KRAS、NRAS突變對EGFR-TKIs敏感性顯著降低[20-21]；PIK3CA與EGFR基因共突變可導致耐藥，影響EGFR-TKIs的治療療效[18]。5%～20%的EGFR-TKIs耐藥是由c-Met擴增引起的[18,22]。結果顯示LAPTM4B表達與EGFR基因突變有關，為進一步證實LAPTM4B表達與EGFR-TKIs耐藥的關系，本實驗選取其中31例EGFR敏感突變患者接受EGFR-TKIs靶向治療后，繼發T790M突變產生繼發耐藥的標本，并收集比較其相應的EGFR-TKIs治療前配對標本的LAPTM4B表達，結果顯示EGFR-TKIs治療后LAPTM4B表達顯著高于EGFR-TKIs治療前，差異有統計學意義。結果證實LAPTM4B表達與EGFR-TKIs繼發耐藥基因T790M突變有關。

既往研究發現，siRNAs降低LAPTM4B的表達可抑制自噬小體的成熟和自噬流的形成，而轉染LAPTM4B質粒使其過表達可挽救并促進代謝應激中自噬流的形成，LAPTM4B過表達在自噬中發揮重要作用[23-24]。眾所周知，自噬既是腫瘤抑制機制亦是腫瘤保護機制，此“雙刃劍”的作用在腫瘤形成及治療中存在較大爭議。自噬可抵抗缺氧、營養缺乏和化療藥物暴露等惡劣環境，有助于腫瘤細胞適應壓力應激并存活，因而自噬成為腫瘤的保護機制。研究發現自噬在骨肉瘤、卵巢癌和肺癌的化療耐藥中發揮重要作用[24-27]。Tan等[5]研究發現LAPTM4B與inactive EGFR核內體上的相互作用，并招募ATG5，從而促進EGFR與自噬抑制劑Rubicon的結合，進而使腫瘤促進因子Beclin 1從Rubicon-Beclin 1復合物中分離觸發自噬。LAPTM4B還可通過直接激活自噬相關基因ATG3轉錄調控自噬[23]。Miao等[28]證實LAPTM4B的表達與EGFR的激活呈正相關；Beclin 1通過LAPTM4B的N末端和C末端的結構域與LAPTM4B相互作用，并與EGFR競爭與LAPTM4B的結合，進而介導胃癌細胞對EGFR-TKIs的耐藥。這一系列機制均導致自噬增強，并發揮保護腫瘤的作用，導致EGFR-TKIs的耐藥。在NSCLC中LAPTM4B表達顯著增加時，可能與LAPTM4B觸發自噬活性，自噬發揮腫瘤保護機制產生EGFR-TKIs的耐藥，并引起EGFR-TKIs繼發耐藥基因T790M突變。

綜上所述，LAPTM4B可能通過自噬途徑參與EGFR-TKIs的耐藥；還可通過增加藥物外排、減少藥物核定位和藥物誘導的DNA損傷，參與EGFR-TKIs的耐藥[24]。因此，作者認為靶向LAPTM4B可能有助于增強EGFR-TKIs的治療效果。LAPTM4B可能是抑制腫瘤生長或使腫瘤對化療敏感的新的重要治療靶點。