SPTBN1對結直腸腺癌細胞及其多倍體腫瘤巨細胞生物學行為的影響及分子機制

陳 靜，曹立宇，白真真，溫奕巽，王 玥

結直腸腺癌是最常見的消化系統惡性腫瘤，其發病率和病死率分別位居惡性腫瘤的第3位和第2位[1]。目前，結直腸腺癌的治療首選手術切除并輔以化療、放療、靶向治療和免疫治療等，部分患者行規范化治療后仍會復發或轉移[2]。近年研究發現結直腸腺癌的復發與轉移可能與多倍體腫瘤巨細胞(polyploid giant cancer cells, PGCCs)的形成有關[3]。PGCCs是指細胞核大小至少是常規癌細胞的3倍或至少有3個核的細胞[4]。應用結直腸腺癌一線化療藥奧沙利鉑誘導PGCCs并研究其分子機制有望突破結直腸腺癌的臨床治療難題。βⅡ-血影蛋白1(spectrin beta chain, non-erythrocytic 1, SPTBN1)是一種重要的細胞骨架蛋白，研究發現SPTBN1與多種癌癥相關，并且SPRBN1的表達和功能在不同腫瘤階段或類型之間存在差異[5]。SPTBN1在肝細胞癌、肺癌和胰腺癌中的表達下降，SPTBN1表達降低可促進腫瘤的發生、發展[6-8]。然而，SPTBN1是否調控結直腸腺癌的惡性進展，目前尚未見相關文獻報道。本實驗著重探討SPTBN1對結直腸腺癌細胞及其PGCCs生物學行為的影響，期望為臨床治療結直腸腺癌提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料收集2021年12月～2022年3月安徽醫科大學附屬阜陽醫院存檔的結直腸腺癌組織及配對癌旁正常組織樣本(距癌組織>2 cm)10例，樣本均經病理檢查確診。其中男性6例，女性4例。患者術前均未接受放療、化療及其他治療。

1.2 數據庫信息應用UALCAN、GEPIA、TCGA portal和CPTAC數據庫分析SPTBN1在泛癌和結直腸腺癌中mRNA及蛋白的表達；應用Kaplan-Meier Plotter、PrognoScan和UALCAN數據庫探索SPTBN1與結直腸腺癌患者預后的關系。

1.3 試劑SPTBN1(DF8341)、PTPRN2(AF9171)、E-cadherin(AF0131)及β-actin抗體，均購自Affinity公司。Western blot試劑盒購自武漢碧云天生物公司。PTPRN2-siRNA序列及SPTBN1-siRNA序列由上海吉瑪生物公司合成。奧沙利鉑由MedChemExpress公司提供。

1.4 細胞培養及PGCCs的誘導HCT116和LOVO細胞均購自American Tissue Culture Collection公司。HCT116和LOVO細胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的1640培養基，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。當細胞密度約70%時，分別在HCT116和LOVO細胞中加入10 μmol/L和25 μmol/L奧沙利鉑繼續培養48 h，每天更換培養基直至出現含多核或巨大胞核的細胞即為PGCCs，即為處理組細胞HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs。

1.5 Western blot法收集結直腸腺癌組織標本、結直腸腺癌細胞及PGCCs，加入RIPA裂解液提取總蛋白，用6%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。加入一抗SPTBN1(稀釋比1 ∶2 000)、PTPRN2(稀釋比1 ∶2 000)和β-actin(稀釋比1 ∶10 000)4 ℃冰箱過夜，再加入HRP標記的兔二抗(稀釋比1 ∶10 000)室溫孵育2 h，利用凝膠成像儀曝光并記錄。

1.6 平板克隆實驗細胞達70%～80%融合度時，消化獲得單細胞懸液，計數并將細胞稀釋成每毫升30、60、120個細胞加入到12孔板中，培養1～2周直至出現肉眼可見的細胞團。用無水甲醇固定30 min，加入0.1%結晶紫室溫染色30 min，顯微鏡下計數。

1.7 劃痕實驗細胞消化后平鋪于6孔板上，待細胞均勻、單層鋪滿整個孔后，用無菌槍頭垂直均勻的劃出劃痕，分別在0、12、24 h于同一位置拍照，用Image J軟件測量兩組細胞的劃痕面積。劃痕指數=(0 h的劃痕面積-指定時間點的劃痕面積)/0 h的劃痕面積。

1.8 細胞轉染實驗選處于對數生長期的細胞，待細胞密度達50%～60%開始轉染。具體操作流程參考試劑盒說明書。轉染48 h檢測細胞蛋白表達狀況。PTPRN2-siRNA序列：5′-GAACGAUGGAGUG UUUGGATTUCCAAACACUCCAUCGUUCTT-3′；SPTBN1-siRNA序列：5′-ACCUUCGAGAUGGACGGAUGC UCAU-3′。

2 結果

2.1 SPTBN1在泛癌和結直腸腺癌組織中的表達CPTAC數據庫分析顯示，在包含結直腸腺癌在內的大部分癌癥中SPTBN1的蛋白表達水平明顯低于癌旁正常組織(圖1A、B)。進一步分析SPTBN1蛋白表達與結直腸腺癌臨床病理特征的相關性發現，其與結直腸腺癌臨床分期密切相關。與癌旁正常組織相比，SPTBN1蛋白在不同分期結直腸腺癌組織中的表達均顯著降低，且隨著臨床分期的增高SPTBN1蛋白表達呈下降趨勢(圖1C)。

圖1 CPTAC數據庫分析SPTBN1蛋白在泛癌及結直腸腺癌中的表達：A.SPTBN1蛋白在泛癌和癌旁正常組織中的表達(藍色柱表示正常組織，紅色柱表示癌組織)；B.SPTBN1蛋白在結直腸腺癌及癌旁正常組織中的表達；C.結直腸腺癌臨床分期與SPTBN1蛋白表達的關系；*P<0.05，***P<0.001

2.2 SPTBN1表達與結直腸腺癌患者預后的關系PrognoScan數據庫分析顯示，在GSE17537和GSE17536數據集中SPTBN1低表達患者的總生存率(圖2A)、無瘤生存率(圖2B)和疾病特異生存率(圖2C)明顯短于高表達患者。此外，Kaplan-Meierplotter(圖2D)、UALCAN(圖2E)和Oncolnc(圖2F)數據庫進一步證實了SPTBN1高表達患者的總生存率明顯高于低表達患者。結果提示，SPTBN1低表達與結直腸腺癌患者的不良預后呈正相關。

圖2 SPTBN1表達與結直腸腺癌患者的預后關系：PrognoScan數據庫分析SPTBN1表達與結直腸腺癌患者總生存率(A)、無瘤生存率(B)和疾病特異生存率(C)的關系；Kaplan-Meierplotter數據庫(D)、UALCAN數據庫(E)、Oncolnc數據庫(F)分析SPTBN1表達與結直腸腺癌患者總生存率的關系

2.3 PGCCs中SPTBN1的表達水平及其增殖、遷移能力的變化Western blot檢測結果顯示，SPTBN1蛋白在結直腸腺癌組織中的表達水平明顯低于癌旁正常組織(圖3A)。此外，Western blot實驗分析結果顯示SPTBN1在HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs細胞中的表達量均明顯低于HCT116及LOVO細胞(圖3B)。平板克隆實驗表明：與HCT116及LOVO細胞相比，HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs細胞的增殖能力更強(圖3C)；劃痕實驗發現：HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs細胞具有更強的遷移能力(圖3D)。

圖3 SPTBN1在結直腸腺癌中的表達及PGCCs的功能實驗：A.Western blot法檢測SPTBN1蛋白在結直腸腺癌組織和癌旁正常組織中的表達；B.Western blot法檢測SPTBN1在對照組HCT116和LOVO細胞和處理組HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs中的表達；C.平板克隆實驗比較奧沙利鉑處理前后細胞的增殖能力；D.劃痕實驗顯示經奧沙利鉑處理前后細胞的遷移能力

2.4 敲低SPTBN1對結直腸腺癌PGCCs細胞增殖和遷移的影響應用siRNA敲低結直腸腺癌細胞中SPTBN1的表達水平后進行功能實驗。平板克隆實驗表明，應用siRNA敲低SPTBN1表達后HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs細胞克隆數明顯高于陰性對照組(圖4A)。劃痕實驗結果顯示，SPTBN1敲低組HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs細胞劃痕愈合度明顯高于陰性對照組(圖4B)。

圖4 敲低SPTBN1對HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs細胞增殖和遷移的影響：A.平板克隆實驗檢測敲低SPTBN1后HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs的增殖能力；B.劃痕愈合實驗比較敲低SPTBN1后HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs的遷移能力

2.5 PTPRN2/SPTBN1/E-cadherin軸的調控機制GEPIA數據庫分析發現，在結直腸腺癌中SPTBN1表達與E-cadherin、PTPRN2表達呈顯著正相關(圖5A、B)。Western blot法檢測結果顯示，與陰性對照組相比，SPTBN1敲低組HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs中E-cadherin蛋白表達水平明顯下降(圖5C)；PTPRN2敲低組HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs中SPTBN1、E-cadherin蛋白表達水平明顯低于陰性對照組(圖5D)。

圖5 SPTBN1可能的調控機制：A、B.GEPIA數據庫分析在結直腸腺癌中SPTBN1與E-cadherin、PTPRN2之間的關系；C.Western blot法檢測在結直腸腺癌PGCCs中敲低SPTBN1前、后E-cadherin的表達變化；D.Western blot法檢測在結直腸腺癌PGCCs中敲低PTPRN2前、后SPTBN1和E-cadherin的表達變化

3 討論

近年，結直腸腺癌的發病率和病死率逐年增加。隨著治療方法的改進，結直腸腺癌的總體生存率有所提高，但化療后的復發和轉移仍是患者主要的死亡原因[9]。研究發現，奧沙利鉑誘導的PGCCs的增殖和遷移能力強于未處理的癌細胞[10]。因此，探究化療藥誘導PGCCs的具體作用及分子機制對結直腸腺癌的治療具有指導意義。

SPTBN1是血影蛋白家族中最常見的非紅細胞亞型[11]，在胚胎發育、神經系統疾病、心血管疾病、骨質疏松癥和聽力喪失中發揮重要作用[12-14]。

SPTBN1通過參與Notch、NF-κB和Wnt/β-catenin信號通路來介導腫瘤的發生、發展[5,8]。在乳腺癌和卵巢癌中SPTBN1低表達通過上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)促進腫瘤的遷移[15-17]。本實驗中，CPTAC數據庫和Western blot法檢測結果均顯示，SPTBN1蛋白在結直腸腺癌組織中的表達水平明顯低于癌旁正常組織。生物信息數據分析顯示，SPTBN1低表達與結直腸腺癌患者的不良預后呈正相關。本實驗利用奧沙利鉑誘導的HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs細胞的增殖和遷移能力高于未處理的HCT116和LOVO細胞，而且SPTBN1蛋白在PGCCs中的表達量明顯低于HCT116和LOVO細胞。因此，作者推測SPTBN1可能在抑制結直腸腺癌的惡性生物學行為中發揮重要作用。

PTPRN2屬于蛋白酪氨酸磷酸酶家族，參與胰島素和神經內分泌遞質的胞吞過程[18-19]。文獻報道，miR-425通過下調PTPRN2促進肝癌的增殖、遷移和侵襲[20-21]。E-cadherin是EMT中重要的上皮標志物蛋白，其表達下降是腫瘤發生轉移、侵襲的前提條件[22]。本實驗中，GSEA數據庫分析發現SPTBN1蛋白表達與E-cadherin、PTPRN2蛋白表達呈正相關。敲低HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs細胞中的SPTBN1后，E-cadherin蛋白表達下降；在上述細胞中敲低PTPRN2后，SPTBN1蛋白和E-cadherin蛋白的表達水平明顯降低。結果提示，PTPRN2/SPTBN1/E-cadherin通路可能共同參與抑制結直腸腺癌的增殖和遷移。

綜上所述，本實驗驗證SPTBN1在結直腸腺癌中發揮抑癌作用，提示SPTBN1可能是結直腸腺癌的潛在治療靶點。但本實驗對于PTPRN2/SPTBN1/E-cadherin通路在調控結直腸腺癌增殖與遷移能力方面的研究尚存在不足，SPTBN1在結直腸腺癌中的分子機制尚未完全驗證。本課題組將進一步對PTPRN2/SPTBN1/E-cadherin通路進行深入探究，為治療結直腸腺癌提供新的分子靶點。